分析方法论

样本采集

鼻咽拭子采集标准流程——病毒溯源中的首步质量关键

原理鼻咽拭子采集是病毒溯源中获取呼吸道样本的核心手段。鼻咽部是多数呼吸道病毒（流感病毒、冠状病毒、RSV等）感染后最早且病毒载量最高的定植部位。植绒拭子利用垂直排列的尼龙纤维结构，通过静电吸附和物理缠结高效捕获脱落的上皮细胞及附着的病毒颗粒...

试剂盒: Copan FLOQSwabs · 样本: 鼻咽拭子 · ~~5 min/样本

生物信息分析

BWA-MEM序列比对——病毒重测序数据比对到参考基因组

原理BWA-MEM采用BWT-FM索引将参考基因组压缩为可快速查询的后缀数组。比对算法分三阶段：种子链生成（SMEM seeding找到参考基因组中的最大精确匹配）、链内扩展（Salvador seeding在种子间做局部比对）、Smith...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTQ文件+参考基因组FASTA · ~~10 min/样本（8核）

免疫学检测

间接免疫荧光——IFA原位病毒抗原检测与亚细胞定位

原理IFA保留细胞自然结构：病毒感染的细胞用4%多聚甲醛固定（交联蛋白保存抗原性），Triton X-100透化使抗体进入。一抗靶向病毒蛋白（如S蛋白、N蛋白），在不同亚细胞位置结合。荧光标记二抗（如Alexa Fluor 488-抗兔Ig...

试剂盒: SARS-CoV/SARS-CoV-2 Nucleocapsid Antibody (Rabbit Polyclonal) · 样本: 病毒感染细胞爬片（多聚甲醛固定） · ~~4 h（含固定+透化+抗体孵育）

高通量测序

PacBio HiFi测序——高准确度长读长病毒基因组组装方案

原理PacBio单分子实时测序（SMRT）在零模波导孔（ZMW）中观察单个DNA聚合酶合成时的荧光标记dNTP掺入。HiFi模式建立环形SMRTbell文库（两端发卡接头使模板成环），聚合酶反复滚环测序同一分子——多次subread经CCS...

试剂盒: SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0 · 样本: 高分子量病毒DNA（>300 ng, >15 kb） · ~~4 h文库+20 h测序（含CCS）

高通量测序

宏基因组鸟枪法测序——无偏倚病原体筛查策略

原理宏基因组鸟枪法（mNGS）从临床样本中直接提取总核酸，构建测序文库后高通量测序，将产生的reads与参考数据库比对进行物种分类注释。与传统靶向PCR相比，mNGS无需预先知道目标病原体，理论上可覆盖所有病毒、细菌、真菌和寄生虫的核酸。检...

试剂盒: 不适用 · 样本: 临床样本总核酸（DNA+RNA, >10 ng） · ~~8 h文库+24 h测序+4 h分析

高通量测序

二代vs三代测序：病毒溯源场景下的技术选择框架

原理测序平台选择影响病毒溯源的全部下游分析。核心评判维度为：读长、准确率、数据量、成本和便携性。短读长平台（Illumina）读长150-300 bp但单碱基准确率>99.9%，适合SNP鉴定和扩增子测序。长读长平台（Nanopore、Pa...

试剂盒: 不适用 · 样本: 取决于平台选择 · ~取决于平台选择

生物信息分析

FastQC测序数据质量评估——病毒基因组数据前处理第一步

原理FastQC读取FASTQ文件的每条read，对11个维度做统计分析：Basic Statistics（总数/长度/GC%）、Per Base Sequence Quality（碱基位置-Q值曲线）、Per Sequence Quali...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTQ.gz测序文件 · ~~5 min/样本（8核）

生物信息分析

Trimmomatic接头与低质量序列过滤——病毒测序数据清洗标准流程

原理Trimmomatic用滑动窗口评估局部碱基质量：从Read 5'端开始，4 bp窗口内平均Q值<阈值则截断。接头检测基于Palindrome模式——Read 1和Read 2末端可互补配对即判为接头。支持单端和双端模式，双端模式下配对...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTQ.gz文件（经FastQC评估） · ~~10 min/样本（8核）

生物信息分析

SPAdes基因组组装——病毒全基因组de novo组装方法

原理SPAdes基于多k-mer de Bruijn图策略：同时使用多个k-mer长度（如k=21,33,55,77）构建图，用较小k-mer填补低覆盖度区域、较大k-mer解析重复区。各k-mer图的contig通过Graph Simpl...

试剂盒: 不适用 · 样本: Trimmomatic清洗后的PE FASTQ文件 · ~~30 min/样本（32 GB RAM）

生物信息分析

Kraken2宏基因组分类——临床样本病原快速鉴定流程

原理Kraken2将参考基因组数据库中的每个k-mer（默认k=35）映射到包含它的最低分类节点（LCA节点），构建k-mer→TaxID哈希表。查询时将reads连续k-mer与哈希表匹配，每条read根据命中k-mer集合的LCA推断分...

试剂盒: 不适用 · 样本: 去除宿主reads的FASTQ文件 · ~~15 min/样本（含建库索引时间）

系统发育分析

BEAST贝叶斯分子钟定年——病毒溯源时间标定方法

原理BEAST将分子钟模型和溯时（time-calibrated）系统发育包装入贝叶斯MCMC框架。核心假设：序列分歧度与采样时间间隔成正比——越早的样本累积越多突变。BEAST用MCMC同时采样树拓扑、替代速率、MRCA时间和群体动态参数...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTA比对文件+采样日期元数据 · ~~2-48 h（取决于MCMC链长）

系统发育分析

RAxML-NG最大似然系统发育——多核CPU/GPU加速方案

原理RAxML-NG是经典的RAxML重写版，专为大规模系统发育推断优化。核心算法采用Lazy Subtree Rearrangement——SPR（Subtree Pruning and Regrafting）搜索树拓扑时不完全重新评估似...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTA或PHYLIP比对文件 · ~~30 min/数据集（200条序列，8核）

系统发育分析

MrBayes贝叶斯系统发育——后验概率与拓扑不确定性评估

原理MrBayes基于贝叶斯定理：P(Tree|Data) ∝ P(Data|Tree) × P(Tree)。通过Metropolis-coupled MCMC（MCMCMC）运行多条马尔可夫链（冷链+加热链），加热链在参数空间中更自由地移...

试剂盒: 不适用 · 样本: NEXUS格式比对文件 · ~~4-48 h（取决于MCMC链长和序列数）

系统发育分析

PhyML最大似然建树——aLRT分支支持度快速检验

原理PhyML采用同时优化树拓扑和分支长度的JTT（Jones-Taylor-Thornton）或替代矩阵。独特的NNI+SPR混合搜索策略：先做快速NNI（Nearest Neighbor Interchange）达到局部最优，再做SPR...

试剂盒: 不适用 · 样本: PHYLIP或FASTA比对文件 · ~~15 min/数据集（200条序列）

系统发育分析

TempEst分子钟检验——病毒序列时间信号评估与异常检测

原理TempEst对导入的ML树做root-to-tip回归：以最古老序列为根，计算每个序列到根的遗传距离（替代/位点），然后线性回归遗传距离~采样日期。正的斜率=进化速率估值（替代/位点/年），R²>0.3通常视为足够时间信号支持分子钟分...

试剂盒: 不适用 · 样本: Newick格式ML树+采样日期表 · ~~10 min

免疫学检测

ELISA间接法——病毒特异性IgG/IgM抗体检测标准操作

原理ELISA间接法是最经典的抗体检测模式。病毒抗原预先固定于96孔板底表面（物理吸附），加入待检血清孵育——特异性抗病毒抗体（一抗）与抗原结合。洗涤去除未结合成分后加入酶标二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗人IgG），再次洗涤后加TMB（四甲...

试剂盒: SARS-CoV-2 Spike RBD ELISA Kit · 样本: 血清或血浆（1:100稀释） · ~~3 h/96孔板

免疫学检测

病毒中和实验——微量中和法测定中和抗体滴度

原理中和实验直接测定血清中抗体的生物功能——阻断病毒进入宿主细胞的能力。血清经56℃ 30 min热灭活去除补体活性后，从1:10起做2倍系列稀释。每稀释度与固定剂量病毒（通常100 TCID50）混合，37℃孵育1 h让抗体充分中和。混合...

试剂盒: DMEM高糖培养基 · 样本: 热灭活血清（56℃ 30 min） · ~~4天（含细胞培养和CPE判读）

免疫学检测

Western blot病毒蛋白免疫印迹——特异性抗体确证实验

原理Western blot是分子量分辨率最高的蛋白检测方法。病毒裂解液经SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）按分子量分离蛋白——小蛋白迁移快、大蛋白迁移慢。电泳后电转至PVDF膜，经封闭、一抗（抗病毒蛋白，如抗N蛋白单抗）...

试剂盒: SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein Antibody Detection Kit · 样本: 病毒裂解液（10-30 μg总蛋白/lane） · ~~6 h（含电泳+转膜+抗体孵育）

文库构建

T4连接酶全长建库——末端修复与平端连接标准流程

原理T4 DNA连接酶法建库遵循末端修复→加A→连接→扩增的标准四步流程。机械或酶切打断的DNA片段末端需先经T4 DNA聚合酶和T4 PNK修复为平末端并5'磷酸化，再由Klenow exo-在3'端添加单个dATP形成突出A尾，最后T4...

试剂盒: NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina · 样本: 片段化病毒DNA（100-500 ng） · ~~3 h/12样本

文库构建

扩增子建库与多重PCR——靶向病毒基因组特定区域

原理扩增子建库采用两轮PCR策略：第一轮PCR用靶向引物扩增目标区域，引物5'端携带Illumina Overhang序列（Read 1/Read 2 adapter）；第二轮PCR用双Index引物对Overhang序列退火，引入i5/i...

试剂盒: Q5 High-Fidelity 2X Master Mix · 样本: 纯化DNA/cDNA（>0.1 ng） · ~~2 h/48样本