分析方法论

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minimap2长读长序列比对——病毒三代测序数据的通用比对引擎

原理三代测序（Nanopore、PacBio）读长轻松超过10 kb，但这东西的错误率曾经高达~15%。传统短读长比对工具（比如BWA-MEM）碰到这种又长又吵的数据，要么跑不动，要么结果一塌糊涂。minimap2就是为这个场景设计的——它...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTQ测序读长文件（Nanopore/PacBio/Illumina）及参考基因组FASTA · ~~10-30 min（~1 Gb ONT数据，16线程）

bioinfo

fastp一体化质控：病毒测序数据预处理的高效替代方案

原理fastp 解决的是测序数据预处理中一个很现实的痛点。传统流程里，FastQC 做质控，Cutadapt 切接头，Trimmomatic 做质量修剪——三个工具、三次读盘、三份报告。fastp 把这些操作合并到一次数据扫描里完成。C++...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTQ格式测序数据文件（Illumina/MGI平台，单端或双端） · ~~5-15 min（~10 Gb双端数据，4线程）

bioinfo

iVar——病毒扩增子测序引物修剪与变异检测标准流程

一、原理病毒扩增子测序（ARTIC 网络方案是典型代表）通过多重 PCR 产生数百个重叠扩增子覆盖全基因组。原始 reads 里残留的引物序列、末端低质量碱基，以及引物结合区的突变，都会让下游变异检测和共有序列生成失真。iVar 就是解决这...

试剂盒: 不适用 · 样本: BAM/SAM 比对文件 + BED 引物方案文件 · ~~15–30 min（单样本，含比对与变异检出）

rna

一步法RT-qPCR病毒核酸检测——SYBR Green I与TaqMan探针法定量标准流程

一、原理RT-qPCR把反转录（RT）和荧光定量PCR（qPCR）塞进一个反应管，从病毒RNA直接走到定量结果。它解决的核心问题是：临床样本里的病毒核酸量太少，跑普通PCR连条带都看不到。荧光信号在每个扩增循环被实时采集。模板越多，荧光"起...

试剂盒: TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix · 样本: 鼻咽拭子提取RNA、病毒培养上清、血清/血浆、粪便上清、组织匀浆 · ~~60–90 min（含逆转录与扩增，不含RNA提取；N=96样本整板）

bioinfo

MAFFT多序列比对——病毒基因组系统发育分析的预处理基石

原理多序列比对（MSA）是病毒系统发育分析的第一步。把一堆长短不一、方向各异的病毒基因组序列，按位点一一对齐——这件事做不好，后面的建树、分子钟定年、祖先状态重建全都会跑偏。MAFFT（Multiple Alignment using Fa...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTA格式序列文件（核苷酸或氨基酸） · ~~1-30 min（取决于序列数量和长度）

library

病毒探针杂交捕获富集——液相杂交靶向病毒序列富集与测序

原理临床样本里的病毒核酸通常只占核酸总量的万分之一不到。直接拿去做宏基因组测序，99%以上的 reads 都是宿主和背景微生物，病毒信号淹没在噪音里。病毒探针杂交捕获要解决的就是这个信噪比问题：用一套人工合成的生物素标记寡核苷酸探针，在溶液...

试剂盒: Twist Comprehensive Viral Research Panel · 样本: 临床样本总核酸提取物（血清/血浆/鼻咽拭子/组织匀浆）、Illumina测序文库 · ~~24 h（含过夜杂交16–18 h，8–16样本/反应）

样本采集

Freyja废水变异株解卷积——基于等位基因频率的群体变异监测

原理废水基因组监测的基本思路不复杂：感染者排出含有病毒核酸的粪便和呼吸道分泌物，这些核酸进入下水道后混合在一起，形成一份"全社区"的病毒池。传统的废水测序只能告诉你"这里面有多少SARS-CoV-2 RNA&q...

试剂盒: 不适用 · 样本: 废水浓缩液提取的混合病毒RNA（靶向扩增子测序数据） · ~~5-10 min（仅计算，不含采样、建库和测序时间）

样本采集

CRISPR-Cas病毒核酸检测——SHERLOCK与DETECTR一步法等温诊断

原理CRISPR-Cas病毒核酸检测的核心逻辑，是把Cas蛋白的"附带切割"活性变成信号放大器。Cas12a和Cas13a这两种蛋白在识别到目标核酸后，除了切割靶标序列，还会非特异性地切割周围的单链DNA或RNA：这个现...

试剂盒: 不适用 · 样本: 鼻咽拭子、血清、尿液、唾液；部分方案支持免提取直接检测 · ~~40-60 min（含扩增），免提取方案可压缩至~30 min

样本采集

病毒受体结合实验——SPR/BLI技术测定病毒-受体亲和力

原理表面等离子共振（SPR）和生物层干涉技术（BLI）是两种无标记实时检测分子互作的生物物理方法。核心原理是：将受体蛋白（如ACE2）固定在传感器表面，让病毒蛋白（如Spike RBD）流过表面，实时监测结合和解离过程，获得结合速率（ka）...

试剂盒: Cytiva Biacore 8K 或 Sartorius Octet R8 · 样本: 纯化病毒RBD蛋白和宿主受体蛋白（如ACE2-Fc） · ~~4 h（6个浓度）

样本采集

数字PCR绝对定量——单分子水平的病毒载量检测

原理数字PCR（dPCR）将反应体系分割成数万个微滴或微孔，每个单元包含0个或1个靶分子。经过PCR扩增后，通过荧光信号统计阳性单元数，用泊松分布公式直接计算靶分子的绝对拷贝数，不需要标准曲线。与qPCR相比，dPCR的优势在于：不受扩增效...

试剂盒: Bio-Rad QX200 ddPCR系统 或 Thermo Fisher QuantStudio 3D · 样本: 病毒核酸提取物（DNA或cDNA） · ~~3 h（24样本）

样本采集

Nextclade——病毒基因组突变谱与谱系一键分型

原理拿到一条病毒基因组序列，第一个问题往往是：它属于哪个谱系、带了哪些突变？Nextclade 就是干这个的。它把_query_序列跟参考基因组做比对，逐个位置找出核苷酸和氨基酸层面的差异，再根据这些突变给出 Pango 谱系分类。跟 Pa...

试剂盒: 不适用 · 样本: 病毒基因组 FASTA 文件 · ~~10 min（100 序列）

样本采集

宏基因组组装——无偏倚病原体基因组重建

原理宏基因组组装是从复杂环境样本（如水体、土壤、临床标本）的混合测序数据中重建完整或近完整基因组序列的计算方法。核心逻辑是利用序列重叠（overlap）将短读长拼接为长片段（contig），再通过配对末端信息或长读长数据将 contig 连...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTQ 测序文件（Illumina/Nanopore/PacBio） · ~~2-6 h（取决于数据量和计算资源）

样本采集

病毒分离培养——活病毒获取与表型分析基础

原理病毒分离培养是将临床标本或环境样本中的活病毒接种至敏感宿主细胞或实验动物，使其增殖并获得足够量用于后续分析的方法。核心逻辑是利用病毒对宿主细胞的专性寄生特性，在体外模拟病毒感染过程。与核酸检测直接检测病毒遗传物质不同，病毒分离培养获得的...

试剂盒: 不适用 · 样本: 鼻咽拭子、肺泡灌洗液、血液 · ~~3-14 天

样本采集

鼻咽拭子采集标准流程——病毒溯源中的首步质量关键

原理鼻咽拭子采集是病毒溯源中获取呼吸道样本的核心手段。鼻咽部是多数呼吸道病毒（流感病毒、冠状病毒、RSV等）感染后最早且病毒载量最高的定植部位。植绒拭子利用垂直排列的尼龙纤维结构，通过静电吸附和物理缠结高效捕获脱落的上皮细胞及附着的病毒颗粒...

试剂盒: Copan FLOQSwabs · 样本: 鼻咽拭子 · ~~5 min/样本

生物信息分析

BWA-MEM序列比对——病毒重测序数据比对到参考基因组

原理BWA-MEM采用BWT-FM索引将参考基因组压缩为可快速查询的后缀数组。比对算法分三阶段：种子链生成（SMEM seeding找到参考基因组中的最大精确匹配）、链内扩展（Salvador seeding在种子间做局部比对）、Smith...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTQ文件+参考基因组FASTA · ~~10 min/样本（8核）

免疫学检测

间接免疫荧光——IFA原位病毒抗原检测与亚细胞定位

原理IFA保留细胞自然结构：病毒感染的细胞用4%多聚甲醛固定（交联蛋白保存抗原性），Triton X-100透化使抗体进入。一抗靶向病毒蛋白（如S蛋白、N蛋白），在不同亚细胞位置结合。荧光标记二抗（如Alexa Fluor 488-抗兔Ig...

试剂盒: SARS-CoV/SARS-CoV-2 Nucleocapsid Antibody (Rabbit Polyclonal) · 样本: 病毒感染细胞爬片（多聚甲醛固定） · ~~4 h（含固定+透化+抗体孵育）

高通量测序

PacBio HiFi测序——高准确度长读长病毒基因组组装方案

原理PacBio单分子实时测序（SMRT）在零模波导孔（ZMW）中观察单个DNA聚合酶合成时的荧光标记dNTP掺入。HiFi模式建立环形SMRTbell文库（两端发卡接头使模板成环），聚合酶反复滚环测序同一分子——多次subread经CCS...

试剂盒: SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0 · 样本: 高分子量病毒DNA（>300 ng, >15 kb） · ~~4 h文库+20 h测序（含CCS）

高通量测序

宏基因组鸟枪法测序——无偏倚病原体筛查策略

原理宏基因组鸟枪法（mNGS）从临床样本中直接提取总核酸，构建测序文库后高通量测序，将产生的reads与参考数据库比对进行物种分类注释。与传统靶向PCR相比，mNGS无需预先知道目标病原体，理论上可覆盖所有病毒、细菌、真菌和寄生虫的核酸。检...

试剂盒: 不适用 · 样本: 临床样本总核酸（DNA+RNA, >10 ng） · ~~8 h文库+24 h测序+4 h分析

高通量测序

二代vs三代测序：病毒溯源场景下的技术选择框架

原理测序平台选择影响病毒溯源的全部下游分析。核心评判维度为：读长、准确率、数据量、成本和便携性。短读长平台（Illumina）读长150-300 bp但单碱基准确率>99.9%，适合SNP鉴定和扩增子测序。长读长平台（Nanopore、Pa...

试剂盒: 不适用 · 样本: 取决于平台选择 · ~取决于平台选择

生物信息分析

FastQC测序数据质量评估——病毒基因组数据前处理第一步

原理FastQC读取FASTQ文件的每条read，对11个维度做统计分析：Basic Statistics（总数/长度/GC%）、Per Base Sequence Quality（碱基位置-Q值曲线）、Per Sequence Quali...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTQ.gz测序文件 · ~~5 min/样本（8核）