分析方法论

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超速离心与密度梯度离心——病毒颗粒浓缩与纯化标准流程

原理病毒颗粒大多 20–200 nm，跟细胞碎片、外泌体、游离核酸挤在一起。要做病毒溯源测序，先得把完整颗粒分出来，不然宿主背景会把有效数据冲淡。超速离心干的就是这件事：几万到几十万 × g 的离心力，让不同密度、不同大小的颗粒各就各位。差...

试剂盒: 无专用试剂盒（核心耗材：CsCl、蔗糖、OptiPrep、超速离心管） · 样本: 病毒培养上清、粪便滤液、污水浓缩液 · ~~4–6 h（6–12 样本/批，过夜平衡梯度另计）

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血凝与血凝抑制实验（HA/HAI）——病毒血凝滴度测定与血清学检测标准流程

一、原理流感病毒、副流感病毒包膜上的血凝素蛋白（HA）抓住红细胞表面的唾液酸受体，把红细胞连成网状，孔底出现雾状凝集。特异性抗体先占住 HA，凝集被阻断，红细胞沉成纽扣状。前者是 HA 试验，测病毒凝集力；后者是 HAI 试验，测血清抗体。...

试剂盒: RDE (II) "SEIKEN" 受体破坏酶（Denka Seiken） · 样本: 鸡胚尿囊液/病毒培养上清（HA）；RDE 预处理血清（HAI） · ~HA ~45 min；HAI ~2 h（96 孔板 8 样本，不含 RDE 过夜处理）

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透射电镜负染色——病毒颗粒形态学鉴定标准流程

原理病毒颗粒本身电子密度低，直接上电镜几乎看不见。负染色把重金属盐溶液滴在颗粒表面，把背景和颗粒外围染深。病毒本身保持亮色，轮廓和表面结构像浮雕一样凸出来。核心逻辑是染背景而不是染颗粒，几分钟出图。悬液里病毒浓度低于 10^6 颗粒/mL ...

试剂盒: 无专用试剂盒，染液自行配制（2% 磷钨酸 / 1% 醋酸铀酰） · 样本: 病毒培养上清、粪便澄清液等临床悬液 · ~~30-45 min（1 样本）

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假病毒中和实验——荧光素酶报告基因法测定中和抗体滴度标准流程

一、原理中和抗体挡住病毒进入细胞，是评估感染免疫和疫苗效果的关键指标。活病毒中和实验（PRNT）要在 BSL-3 里做，周期长，判读靠人眼数噬斑。假病毒法换个思路。把目标病毒的刺突糖蛋白（S 蛋白）装配到复制缺陷的骨架病毒上。骨架里塞一个荧...

试剂盒: SARS-CoV-2 Spike 假病毒（Sino Biological）＋ Bright-Glo 荧光素酶检测系统（Promega） · 样本: 血清 / 血浆 · ~~48–72 h（96 样本）

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TCID50与空斑实验——病毒滴度测定与空斑纯化标准流程

原理病毒溯源要回答两件事：样本里有多少活病毒，测序用的病毒纯不纯。TCID50 和空斑实验就是干这个的。TCID50 是 50% 组织培养感染剂量。样本 10 倍梯度稀释后接种细胞。记录出现细胞病变（CPE）的孔数，用 Reed-Muenc...

试剂盒: 无专用商品化试剂盒（DMEM、琼脂糖、Avicel、结晶紫自配） · 样本: 病毒培养上清 / 感染细胞悬液 · ~3–7 天/株（含培养观察，手工操作约 2 h）

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RT-LAMP环介导等温扩增——无需热循环仪的病毒核酸快速检测流程

一、原理RT-PCR 做病毒核酸快检，绕不开热循环仪和两小时上下的升温降温循环。RT-LAMP 解决的就是这个：整管反应放在 60~65 ℃ 的恒温环境里，20~40 分钟出结果。水浴锅、加热块、车载保温箱都能干。核心逻辑有两点。一是 Bs...

试剂盒: WarmStart LAMP Kit (DNA & RNA)（NEB） · 样本: 鼻咽拭子粗裂解液、提取的病毒 RNA、病毒培养上清 · ~~40 min（8 样本）

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Pangolin谱系分型：SARS-CoV-2基因组流行病学的动态命名与自动分配

一、原理变异株一个接一个冒出来，溯源报告里总不能写「和 BA.2 有点像」。Pangolin（Phylogenetic Assignment of Named Global Outbreak Lineages）解决的就是这件事：把任意一条 ...

试剂盒: 不适用 · 样本: SARS-CoV-2 一致性基因组 FASTA 文件 · ~~5 min（100 条基因组）

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HyPhy选择压力分析——病毒适应性进化的dN/dS全谱检测流程

原理病毒蛋白编码基因在宿主免疫、抗病毒药物和跨种传播三重压力下发生适应性进化。鉴定哪些氨基酸位点受到了正选择（dN/dS > 1）还是净化选择（dN/dS < 1），是理解病毒溯源中关键分子事件的前提。HyPhy 在一个统一的系统发育框架下...

试剂盒: 不适用 · 样本: 密码子多序列比对文件（FASTA/NEXUS）及对应系统发育树（Newick） · ~~10-60 min（100条序列全流程约30 min）

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minimap2长读长序列比对——病毒三代测序数据的通用比对引擎

原理三代测序（Nanopore、PacBio）读长轻松超过10 kb，但这东西的错误率曾经高达~15%。传统短读长比对工具（比如BWA-MEM）碰到这种又长又吵的数据，要么跑不动，要么结果一塌糊涂。minimap2就是为这个场景设计的——它...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTQ测序读长文件（Nanopore/PacBio/Illumina）及参考基因组FASTA · ~~10-30 min（~1 Gb ONT数据，16线程）

bioinfo

fastp一体化质控：病毒测序数据预处理的高效替代方案

原理fastp 解决的是测序数据预处理中一个很现实的痛点。传统流程里，FastQC 做质控，Cutadapt 切接头，Trimmomatic 做质量修剪——三个工具、三次读盘、三份报告。fastp 把这些操作合并到一次数据扫描里完成。C++...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTQ格式测序数据文件（Illumina/MGI平台，单端或双端） · ~~5-15 min（~10 Gb双端数据，4线程）

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iVar——病毒扩增子测序引物修剪与变异检测标准流程

一、原理病毒扩增子测序（ARTIC 网络方案是典型代表）通过多重 PCR 产生数百个重叠扩增子覆盖全基因组。原始 reads 里残留的引物序列、末端低质量碱基，以及引物结合区的突变，都会让下游变异检测和共有序列生成失真。iVar 就是解决这...

试剂盒: 不适用 · 样本: BAM/SAM 比对文件 + BED 引物方案文件 · ~~15–30 min（单样本，含比对与变异检出）

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一步法RT-qPCR病毒核酸检测——SYBR Green I与TaqMan探针法定量标准流程

一、原理RT-qPCR把反转录（RT）和荧光定量PCR（qPCR）塞进一个反应管，从病毒RNA直接走到定量结果。它解决的核心问题是：临床样本里的病毒核酸量太少，跑普通PCR连条带都看不到。荧光信号在每个扩增循环被实时采集。模板越多，荧光"起...

试剂盒: TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix · 样本: 鼻咽拭子提取RNA、病毒培养上清、血清/血浆、粪便上清、组织匀浆 · ~~60–90 min（含逆转录与扩增，不含RNA提取；N=96样本整板）

bioinfo

MAFFT多序列比对——病毒基因组系统发育分析的预处理基石

原理多序列比对（MSA）是病毒系统发育分析的第一步。把一堆长短不一、方向各异的病毒基因组序列，按位点一一对齐——这件事做不好，后面的建树、分子钟定年、祖先状态重建全都会跑偏。MAFFT（Multiple Alignment using Fa...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTA格式序列文件（核苷酸或氨基酸） · ~~1-30 min（取决于序列数量和长度）

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病毒探针杂交捕获富集——液相杂交靶向病毒序列富集与测序

原理临床样本里的病毒核酸通常只占核酸总量的万分之一不到。直接拿去做宏基因组测序，99%以上的 reads 都是宿主和背景微生物，病毒信号淹没在噪音里。病毒探针杂交捕获要解决的就是这个信噪比问题：用一套人工合成的生物素标记寡核苷酸探针，在溶液...

试剂盒: Twist Comprehensive Viral Research Panel · 样本: 临床样本总核酸提取物（血清/血浆/鼻咽拭子/组织匀浆）、Illumina测序文库 · ~~24 h（含过夜杂交16–18 h，8–16样本/反应）

样本采集

Freyja废水变异株解卷积——基于等位基因频率的群体变异监测

原理废水基因组监测的基本思路不复杂：感染者排出含有病毒核酸的粪便和呼吸道分泌物，这些核酸进入下水道后混合在一起，形成一份"全社区"的病毒池。传统的废水测序只能告诉你"这里面有多少SARS-CoV-2 RNA&q...

试剂盒: 不适用 · 样本: 废水浓缩液提取的混合病毒RNA（靶向扩增子测序数据） · ~~5-10 min（仅计算，不含采样、建库和测序时间）

样本采集

CRISPR-Cas病毒核酸检测——SHERLOCK与DETECTR一步法等温诊断

原理CRISPR-Cas病毒核酸检测的核心逻辑，是把Cas蛋白的"附带切割"活性变成信号放大器。Cas12a和Cas13a这两种蛋白在识别到目标核酸后，除了切割靶标序列，还会非特异性地切割周围的单链DNA或RNA：这个现...

试剂盒: 不适用 · 样本: 鼻咽拭子、血清、尿液、唾液；部分方案支持免提取直接检测 · ~~40-60 min（含扩增），免提取方案可压缩至~30 min

样本采集

病毒受体结合实验——SPR/BLI技术测定病毒-受体亲和力

原理表面等离子共振（SPR）和生物层干涉技术（BLI）是两种无标记实时检测分子互作的生物物理方法。核心原理是：将受体蛋白（如ACE2）固定在传感器表面，让病毒蛋白（如Spike RBD）流过表面，实时监测结合和解离过程，获得结合速率（ka）...

试剂盒: Cytiva Biacore 8K 或 Sartorius Octet R8 · 样本: 纯化病毒RBD蛋白和宿主受体蛋白（如ACE2-Fc） · ~~4 h（6个浓度）

样本采集

数字PCR绝对定量——单分子水平的病毒载量检测

原理数字PCR（dPCR）将反应体系分割成数万个微滴或微孔，每个单元包含0个或1个靶分子。经过PCR扩增后，通过荧光信号统计阳性单元数，用泊松分布公式直接计算靶分子的绝对拷贝数，不需要标准曲线。与qPCR相比，dPCR的优势在于：不受扩增效...

试剂盒: Bio-Rad QX200 ddPCR系统 或 Thermo Fisher QuantStudio 3D · 样本: 病毒核酸提取物（DNA或cDNA） · ~~3 h（24样本）

样本采集

Nextclade——病毒基因组突变谱与谱系一键分型

原理拿到一条病毒基因组序列，第一个问题往往是：它属于哪个谱系、带了哪些突变？Nextclade 就是干这个的。它把_query_序列跟参考基因组做比对，逐个位置找出核苷酸和氨基酸层面的差异，再根据这些突变给出 Pango 谱系分类。跟 Pa...

试剂盒: 不适用 · 样本: 病毒基因组 FASTA 文件 · ~~10 min（100 序列）

样本采集

宏基因组组装——无偏倚病原体基因组重建

原理宏基因组组装是从复杂环境样本（如水体、土壤、临床标本）的混合测序数据中重建完整或近完整基因组序列的计算方法。核心逻辑是利用序列重叠（overlap）将短读长拼接为长片段（contig），再通过配对末端信息或长读长数据将 contig 连...

试剂盒: 不适用 · 样本: FASTQ 测序文件（Illumina/Nanopore/PacBio） · ~~2-6 h（取决于数据量和计算资源）