原理
宏基因组鸟枪法（mNGS）从临床样本中直接提取总核酸，构建测序文库后高通量测序，将产生的reads与参考数据库比对进行物种分类注释。与传统靶向PCR相比，mNGS无需预先知道目标病原体，理论上可覆盖所有病毒、细菌、真菌和寄生虫的核酸。检测灵敏度在<1>10⁶ copies/μL间跨越7个数量级。
步骤
1. 总核酸提取与去除宿主
从200 μL临床样本中提取总核酸（DNA+RNA）。RNA样本需反转录为cDNA。宿主核酸去除：用差异裂解法（Saponin处理人细胞）或探针捕获法去除人源DNA/RNA，降低宿主reads至<10>
2. 文库构建与测序
用Nextera XT或NEBNext Ultra II构建DNA文库，RNA用total RNA-seq流程建库。Illumina NextSeq/NovaSeq PE150测序，临床样本推荐每个样本>20M reads。
3. 生物信息分析
标准分析管线：
fastp -i raw.R1.fq.gz -I raw.R2.fq.gz -o clean.R1.fq.gz -O clean.R2.fq.gz
bowtie2 -x hg38 -1 clean.R1.fq.gz -2 clean.R2.fq.gz --un-conc host_removed.fq
kraken2 --db viral_db --report report.txt --output output.txt host_removed.fq
4. 结果验证
Kraken2/Bracken给出物种reads数和相对丰度。阳性必须用特异PCR+Sanger测序验证。同时设阴性对照（水样本）和环境对照以排除试剂和实验室背景污染。
参数选择建议
| 参数 | 推荐值 | 说明 |
|---|---|---|
| 每样本reads数 | 20-50M PE150 | 临床样本最低20M，环境样本50M+ |
| 物种分类工具 | Kraken2+Bracken | 高速k-mer分类+Baysian丰度估计 |
| 宿主数据库 | hg38+人转录组 | 双重过滤去除人源reads |
FAQ
Q：mNGS和靶向PCR哪个更敏感？
A：高载量靶向PCR更敏感（可检出~10 copies/mL）。低载量和未知病原体mNGS远胜——mNGS可检出所有物种而PCR只能检出你找的那个。
Q：怎么区分真正感染和背景污染？
A：三条判据：① 病原体reads数>阴性对照10倍以上；② reads均匀覆盖参考基因组而非局部；③ 同类样本（如呼吸道）预期出现的病原体优先判阳。
Q：宿主reads太多怎么办？
A：正常肺泡灌洗液样本人源reads常>95%。可用Saponin差异裂解（在核酸提取前），或测序后用bowtie2/snap去除，或做探针捕获富集（VirCapSeq-VERT）。
参考文献
- Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 2019;20(6):341-355. DOI: 10.1038/s41576-019-0113-7
- Wilson MR, Sample HA, Zorn KC, et al. Clinical Metagenomic Sequencing for Diagnosis of Meningitis and Encephalitis. N Engl J Med. 2019;380(24):2327-2340. DOI: 10.1056/NEJMoa1803396