原理
数字PCR（dPCR）将反应体系分割成数万个微滴或微孔，每个单元包含0个或1个靶分子。经过PCR扩增后，通过荧光信号统计阳性单元数，用泊松分布公式直接计算靶分子的绝对拷贝数，不需要标准曲线。
与qPCR相比，dPCR的优势在于：不受扩增效率影响，对抑制剂耐受性更强，能够检测低丰度靶标（灵敏度可达0.001%）。在病毒溯源中，dPCR用于精确测定病毒载量、检测罕见突变、验证NGS结果，以及环境样本中病毒浓度的绝对定量。
步骤
1. 样本制备
提取病毒核酸（DNA或RNA），用NanoDrop或Qubit测定浓度和纯度。RNA样本需先反转录为cDNA，可使用随机引物或基因特异性引物。
2. 反应体系配制
将核酸模板、引物、探针（TaqMan或EvaGreen）、dPCR Master Mix混合。引物设计原则与qPCR相同，但dPCR对引物二聚体更敏感，建议用Primer-BLAST验证特异性。
3. 微滴生成或芯片加载
微滴式dPCR（如Bio-Rad QX200）：将20μL反应液与70μL微滴生成油混合，用微滴生成仪产生约20000个微滴。芯片式dPCR（如Thermo Fisher QuantStudio 3D）：将反应液加载到含有20000个微孔的芯片上，用芯片加载仪填充。
4. PCR扩增
标准PCR程序：95°C预变性10 min；94°C变性30 s，55-60°C退火/延伸1 min，40个循环；98°C终延伸10 min。微滴式dPCR需用专用PCR仪（如Bio-Rad C1000），芯片式可用常规实时荧光PCR仪。
5. 数据读取与分析
用微滴读取仪或芯片扫描仪检测每个单元的荧光信号。软件自动判定阳性/阴性单元，根据泊松分布公式计算靶分子浓度：浓度 = -ln(1-p)/V，其中p为阳性比例，V为单元体积。
关键试剂与条件
| 试剂 | 规格 | 用量 | 作用 |
|---|---|---|---|
| dPCR Super Mix | 2X | 10μL | 提供Taq酶、dNTPs、缓冲液 |
| 引物 | 10μM | 各0.9μL | 特异性扩增靶序列 |
| 探针 | 10μM | 0.25μL | TaqMan水解探针，5'端荧光基团 |
| 核酸模板 | — | 1-5μL | 含靶分子的DNA或cDNA |
| 微滴生成油 | — | 70μL | 形成油包水微滴（仅微滴式） |
FAQ
Q：dPCR和qPCR怎么选？
A：需要绝对定量、检测低丰度靶标、或样本含抑制剂时选dPCR。需要高通量、动态范围宽、或做熔解曲线分析时选qPCR。日常病毒载量监测qPCR够用，精准定量或罕见突变检测用dPCR。
Q：dPCR的灵敏度真的比qPCR高吗？
A：理论上dPCR可以检测单分子，实际灵敏度取决于输入样本量。如果qPCR用5μL模板，dPCR也用5μL，两者灵敏度相近。但dPCR可以把全部20μL反应液都用于检测，而qPCR通常只用2-5μL，所以dPCR的有效灵敏度更高。
Q：微滴式和芯片式dPCR有什么区别？
A：微滴式（如Bio-Rad）通量更高（20000微滴），成本较低，但需要专用微滴生成仪和读取仪。芯片式（如Thermo Fisher）操作更简单，可用常规PCR仪，但通量较低（20000微孔），芯片成本较高。
参考文献
- Hindson BJ, et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 2011;83(22):8604-8610. DOI: 10.1021/ac202028g
- Whale AS, et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acids Res. 2012;40(11):e82. DOI: 10.1093/nar/gks203