一、原理
RT-qPCR把反转录（RT）和荧光定量PCR（qPCR）塞进一个反应管，从病毒RNA直接走到定量结果。它解决的核心问题是：临床样本里的病毒核酸量太少，跑普通PCR连条带都看不到。荧光信号在每个扩增循环被实时采集。模板越多，荧光"起跳"越早，这个起跳点就是Ct值（循环阈值）。Ct值和起始模板拷贝数的对数成反比，这是定量的数学底子。
病毒溯源链条里，RT-qPCR是"第一道筛子"。临床样本先过一遍RT-qPCR，Ct<35的阳性样本才往下走测序建库、系统发育分析。数字PCR（dPCR）也能定量病毒核酸，但它直接数分子个数、不需要标准曲线。代价是通量低、试剂贵。RT-qPCR恰恰相反：通量高、成本可控，但依赖标准曲线做相对定量。两者互补，不是替代关系。在COVID-19溯源案例中的应用——RT-qPCR是SARS-CoV-2确诊的WHO推荐方法，所有后续基因组流行病学分析的入口。
二、操作步骤
1. 反应体系配制
全程冰上操作。一步法核心是一管混合酶，同时含逆转录酶和热启动Taq DNA聚合酶。SYBR Green法：Master Mix（含SYBR Green I染料、dNTP、缓冲液、聚合酶）、上下游引物各200–400 nM、模板RNA 1–5 μL，补DEPC水至20 μL。TaqMan法多加一条荧光探针（100–250 nM），探针5′端标FAM/VIC等报告基团，3′端标BHQ1等淬灭基团。
每板必设的对照：阳性对照（已知浓度病毒RNA或体外转录RNA）、NTC（无模板对照，用DEPC水替代模板）、内参基因（如RNase P，验证样本质量和提取效率）。所有样本做2–3孔技术重复。
2. 热循环程序设定
标准三步程序跑下来大约60–90分钟。逆转录（50°C, 15–30 min）→ 预变性（95°C, 2–5 min，激活热启动酶）→ 扩增循环（95°C 15 s变性 + 55–60°C 30 s退火/延伸，共40–45个循环）。荧光在退火/延伸阶段采集。TaqMan探针在此阶段被Taq酶的5′→3′外切酶活性切割，荧光基团脱离淬灭基团，发出信号。SYBR Green在延伸结束时结合双链DNA发光。
SYBR Green法额外一步：扩增结束后跑熔解曲线，从60°C逐步升温到95°C（0.5°C/s），连续读荧光。单一产物对应单一熔解峰。杂峰等于非特异扩增或引物二聚体。这个样本直接报废。
3. 荧光通道与基线设定
TaqMan法按探针标记选通道：FAM走蓝色通道（~520 nm），VIC/HEX走绿色通道（~550 nm）。多重qPCR可在同一管检测靶标基因和内参。SYBR Green统一用FAM/SYBR通道。
基线（baseline）取第3–15循环的荧光平均值。阈值线设在指数扩增期信号显著高于背景的位置。大多数仪器自动设定，手动调也行，但要保证阈值线落在所有样本的指数扩增区。
4. 数据质控与结果判定
有效实验的硬指标：NTC无Ct值（或Ct>40），阳性对照Ct在预期范围（≤30），内参基因Ct<35，技术重复Ct标准差<0.5。标准曲线R²≥0.98，扩增效率E=90–110%（斜率在-3.6到-3.1之间）。SYBR Green法熔解曲线峰形单一，Tm值与阳性对照偏差<0.5°C。
结果判定：Ct<38判阳性，Ct 38–40判灰区（建议原样复测或重新提取），Ct>40或无扩增判阴性。灰区样本不要硬判。复测结果一致再出报告。
三、参数选择建议
| 参数 | 推荐值 | 说明 |
|---|---|---|
| 引物浓度 | 200–400 nM（每条） | 过低灵敏度差，过高易出引物二聚体。先做浓度梯度预实验 |
| 探针浓度（TaqMan） | 100–250 nM | 通常为引物浓度的1/2–1/3。过高背景升高 |
| 模板RNA用量 | 1–5 μL（每20 μL体系） | 总量1 pg–1 μg。超过反应体积10%可能引入抑制剂 |
| 逆转录温度 | 50°C | 高GC模板可升到55–60°C。温度越高特异性越好，产量略降 |
| 退火/延伸温度 | 55–60°C | 按引物Tm值-5°C设定。TaqMan探针Tm比引物高5–10°C |
| 循环数 | 40–45 | 临床样本建议45循环。超过45循环非特异信号风险增加 |
| 扩增效率（E） | 90–110% | E=10(-1/斜率)-1。超出范围需优化引物或Mg²⁺浓度 |
| 技术重复数 | 2–3孔 | Ct标准差应<0.5。超过此值提示移液误差或模板不均 |
四、FAQ
一步法和两步法RT-qPCR怎么选？
一步法全在一个管里完成。开盖少、污染风险低、动手时间短。适合临床诊断和常规检测场景。两步法先反转录得cDNA，再取cDNA做qPCR。多一次开盖，但同一份cDNA可以反复跑多个靶标。做病毒panel筛查或者研究型实验室，两步法更灵活。两步法的反转录用随机引物或Oligo-dT，跟一步法的基因特异性引物不一样，cDNA覆盖面更广。
SYBR Green和TaqMan探针法怎么选？
SYBR Green便宜、体系简单。但染料不挑食，凡是双链DNA都结合，引物二聚体也发光。必须跑熔解曲线验证特异性。适合预算有限、方法开发、大样本初筛。TaqMan探针价格高一截，但探针在引物对之间特异性结合，只识别目标序列。多重检测能力强（不同探针标不同荧光），是临床确诊的首选。溯源场景里：确诊环节用TaqMan，初筛用SYBR Green。
为什么Ct值不能跨实验直接比较？
Ct值不是绝对值。仪器型号、试剂批次、模板稀释方式、基线阈值设在哪，每一样都在"挪"Ct值。同一个阳性样本在A实验室跑出Ct 28，换B实验室可能变成Ct 31。要跨实验比较，必须用标准曲线把Ct换算成拷贝数，或者用同一块板上的校准品做归一化。这也是MIQE指南唠叨了十几年的核心诉求：只报Ct不报标准曲线参数，谁也复现不了你的数据。
参考文献
- Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. DOI: 10.1373/clinchem.2008.112797
- Corman VM, Landt O, Kaiser M, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3):2000045. DOI: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045
- Pereira-Gómez M, Fajardo Á, Echeverría N, et al. Evaluation of SYBR Green real time PCR for detecting SARS-CoV-2 from clinical samples. J Virol Methods. 2021;289:114035. DOI: 10.1016/j.jviromet.2020.114035
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