原理
宏基因组组装是从复杂环境样本（如水体、土壤、临床标本）的混合测序数据中重建完整或近完整基因组序列的计算方法。核心逻辑是利用序列重叠（overlap）将短读长拼接为长片段（contig），再通过配对末端信息或长读长数据将 contig 连接为 scaffold。与靶向扩增子测序不同，宏基因组组装不依赖引物，可无偏倚地恢复样本中所有微生物的基因组信息。在病毒溯源中，宏基因组组装用于从临床或环境样本中直接获取病毒全基因组，无需先分离培养病毒，例如在 SFTS 病毒溯源案例中的应用。
步骤
1. 数据预处理与质控
使用 FastQC 评估原始测序数据质量，Trimmomatic 或 fastp 去除接头序列和低质量碱基（Q<20>
2. 短读长组装
使用 SPAdes 或 metaSPAdes 进行宏基因组组装。metaSPAdes 专为宏基因组设计，采用多 k-mer 策略（k=21, 33, 55, 77, 99, 127）逐步构建 de Bruijn 图，合并不同 k-mer 的组装结果以提高连续性。关键参数：`--meta`（宏基因组模式）、`-m 64`（内存限制 64 GB）、`-t 16`（线程数 16）。组装输出为 contig 文件（FASTA 格式）。
3. 长读长辅助组装（可选）
对于 Nanopore 或 PacBio 长读长数据，使用 Flye 或 Canu 进行组装。Flye 参数：`--meta`（宏基因组模式）、`--nano-raw`（Nanopore 原始数据）、`-g 30k`（估计基因组大小 30 kb，适用于病毒）。长读长组装可跨越重复区域，获得更长的 contig。混合组装（hybrid assembly）使用 Unicycler 或 OPERA-MS，结合 Illumina 短读长的高准确性和 Nanopore 长读长的连续性。
4. Contig 分箱与病毒序列识别
使用 CheckV 评估病毒基因组完整性（完整度、污染率）。完整度>90% 且污染率<5>
5. 基因组注释与分析
使用 Prokka（细菌）或 VirAnnot（病毒）进行基因预测和功能注释。对于 SARS-CoV-2 等已知病毒，可直接比对参考基因组（如 Wuhan-Hu-1）提取变异信息。系统发育分析使用 IQ-TREE 或 BEAST 构建进化树，确定病毒谱系和传播关系。
参数/关键变量
| 参数 | 推荐值 | 说明 |
|---|---|---|
| k-mer 大小（metaSPAdes） | 21, 33, 55, 77, 99, 127 | 多 k-mer 策略提高组装连续性 |
| 内存限制（metaSPAdes） | 64-128 GB | 大型宏基因组需更多内存 |
| 最小 contig 长度 | 1000 bp（metaSPAdes）/ 5000 bp（VirSorter2） | 过滤短 contig 减少假阳性 |
| 病毒完整度阈值（CheckV） | >90% | 高质量病毒基因组标准 |
| 病毒污染率阈值（CheckV） | <5> | 避免嵌合体基因组 |
| BLAST e-value | 1e-5 | 物种注释严格度 |
| 系统发育 bootstrap | 1000 次 | 分支支持度评估 |
FAQ
Q: metaSPAdes 和 Flye 怎么选？
A: metaSPAdes 适合 Illumina 短读长，准确性高但 contig 较短；Flye 适合 Nanopore/PacBio 长读长，contig 更长但错误率较高。临床样本优先选 metaSPAdes（准确性），环境样本优先选 Flye（连续性）。混合组装（Unicycler）可兼顾两者优势。
Q: 宏基因组组装和靶向扩增子测序有什么区别？
A: 靶向扩增子测序（如 16S rRNA、S 基因扩增子）依赖引物，只能检测已知病原体，存在引物偏差。宏基因组组装无偏倚，可发现新病原体，但计算成本高、对低丰度病原体灵敏度低。溯源研究优先选宏基因组组装（无假设发现），监测预警可用扩增子测序（快速筛查）。
Q: 为什么宏基因组组装需要去除宿主序列？
A: 临床样本中宿主 DNA/RNA 占比通常>90%（如鼻咽拭子中人源序列占 95% 以上），不去除会浪费计算资源并降低病原体序列的组装覆盖度。去除宿主序列后，病原体序列占比可提高 10-100 倍，显著提升组装质量。
参考文献
- Nurk S, Meleshko D, Korobeynikov A, Pevzner PA. metaSPAdes: a new versatile metagenomic assembler. Genome Res. 2017;27(5):824-834. DOI: 10.1101/gr.213959.116
- Roux S, et al. CheckV: assessing the quality and completeness of viral genomes. Nat Biotechnol. 2021;39:578-585. DOI: 10.1038/s41587-020-00774-7
- Guo J, et al. VirSorter2: a multi-classifier, expert-guided approach to detect diverse DNA and RNA viruses. Microbiome. 2021;9:37. DOI: 10.1186/s40168-020-00990-y