原理
表面等离子共振（SPR）和生物层干涉技术（BLI）是两种无标记实时检测分子互作的生物物理方法。核心原理是：将受体蛋白（如ACE2）固定在传感器表面，让病毒蛋白（如Spike RBD）流过表面，实时监测结合和解离过程，获得结合速率（ka）、解离速率（kd）和平衡解离常数（KD）。
在病毒溯源中，受体结合实验用于评估变异株与宿主受体的亲和力变化。例如，Omicron BA.1的RBD与ACE2亲和力比原始株高约2-4倍，这解释了其传播力增强的部分原因。SPR和BLI也可用于筛选中和抗体、评估受体结合域突变的功能影响。
步骤
1. 蛋白制备
表达并纯化病毒受体结合蛋白（如SARS-CoV-2 RBD）和宿主受体（如人ACE2胞外域）。RBD通常带His标签，ACE2带Fc标签。蛋白纯度需>90%，浓度用NanoDrop或BCA法测定。
2. 传感器芯片准备
SPR（如Biacore）：用EDC/NHS活化CM5芯片表面，将ACE2-Fc蛋白共价偶联到芯片上，乙醇胺封闭未反应位点。目标偶联量5000-10000 RU。
BLI（如Octet）：将ACE2-Fc蛋白直接加载到Protein A传感器上，利用Fc与Protein A的高亲和力结合，加载量1-2 nm。
3. 结合实验
将RBD蛋白用运行缓冲液（HBS-EP+或PBS-P+）做2倍系列稀释（通常6-8个浓度，从100 nM到0.78 nM）。每个浓度注射120-180 s，解离监测120-300 s。再生步骤用10 mM甘氨酸-HCl pH 2.0洗脱结合蛋白，恢复基线。
4. 数据分析
用仪器自带软件（Biacore Evaluation Software或Octet Analysis Studio）拟合1:1 Langmuir结合模型，获得ka、kd和KD值。KD = kd/ka，值越小表示亲和力越强。拟合优度用χ²值评估，<10>
参数选择建议
| 试剂 | 规格 | 用量 | 作用 |
|---|---|---|---|
| CM5芯片 | 羧甲基葡聚糖 | 1片 | SPR传感器表面，共价偶联蛋白 |
| Protein A传感器 | — | 96孔板 | BLI传感器，捕获Fc融合蛋白 |
| EDC/NHS | 0.4/0.1 M | 各50μL | 活化芯片表面羧基 |
| 乙醇胺 | 1 M pH 8.5 | 50μL | 封闭未反应位点 |
| 甘氨酸-HCl | 10 mM pH 2.0 | 50μL | 再生芯片，洗脱结合蛋白 |
| 运行缓冲液 | HBS-EP+或PBS-P+ | — | 维持蛋白稳定性和结合环境 |
FAQ
Q：SPR和BLI怎么选？
A：SPR灵敏度高、数据质量好，适合发表文章和精确测定KD值，但仪器贵（Biacore约150万）、维护成本高。BLI通量高（96孔板并行）、操作简单、无需流体系统，适合高通量筛选和初步评估，但灵敏度略低。
Q：为什么测出来的KD值和文献不一样？
A：可能原因：蛋白标签不同（His vs Fc）、偶联方式不同（共价 vs 捕获）、缓冲液成分不同（有无Tween-20、BSA）、温度不同（25°C vs 37°C）。比较数据时要确保实验条件一致，最好用同一批蛋白做平行对照。
Q：RBD突变后亲和力没变化，但传播力增强了，为什么？
A：受体亲和力只是传播力的一个因素。免疫逃逸能力、病毒复制效率、上呼吸道嗜性、气溶胶稳定性等都会影响传播力。例如Omicron BA.1的RBD亲和力与Delta相当，但免疫逃逸能力显著增强，导致传播力更高。
参考文献
- Starr TN, et al. Deep mutational scanning of SARS-CoV-2 receptor binding domain reveals constraints on folding and ACE2 binding. Cell. 2020;182(5):1295-1310. DOI: 10.1016/j.cell.2020.08.012
- Yuan M, et al. Structural and functional ramifications of antigenic drift in recent SARS-CoV-2 variants. Science. 2021;373(6557):818-823. DOI: 10.1126/science.abh1139