原理
BWA-MEM采用BWT-FM索引将参考基因组压缩为可快速查询的后缀数组。比对算法分三阶段：种子链生成（SMEM seeding找到参考基因组中的最大精确匹配）、链内扩展（Salvador seeding在种子间做局部比对）、Smith-Waterman精调（对最佳候选区域做完整的带空位全局比对）。病毒基因组极小（<1>
步骤
1. 建立索引
bwa index reference_genome.fasta
生成.fasta.amb/.ann/.bwt/.pac/.sa五个索引文件。病毒参考基因组一次建好，后续反复使用。
2. 比对
bwa mem -t 8 reference_genome.fasta sample_R1.fq.gz sample_R2.fq.gz > aligned.sam
-t指定线程，双端数据直接传入两个FASTQ。
3. SAM转BAM并排序
samtools view -bS aligned.sam | samtools sort -@ 8 -o aligned_sorted.bam
samtools index aligned_sorted.bam
排序+索引是后续变异检测必需的。SAMtools sort支持多线程。
4. 质控与去duplicate
samtools flagstat aligned_sorted.bam查看比对率和配对率（病毒数据期望>80%）。
picard MarkDuplicates标记PCR duplicates——病毒扩增子数据duplicate率可达30-70%，变异检测前必须标记。
参数选择建议
| 参数 | 推荐值 | 说明 |
|---|---|---|
| -M | 推荐启用 | 将split reads标记为secondary，兼容Picard |
| -k | 19 | 最小种子长度，默认19适合100+ bp reads |
| -t | 与CPU一致 | 线程数，BWA-MEM多线程效率高 |
FAQ
Q：比对率很低怎么办（<50>
A：检查参考基因组——可能选了不同亚型或远缘毒株。重新选更接近的参考或做de novo组装。若样本含大量宿主DNA，比对率自然低——宏基因组背景下<10>
Q：BWA-MEM和minimap2怎么选？
A：短读长（<300>1 kb）用minimap2。BWA-MEM在短读长上的比对精度和召回率均最优，minimap2专门优化了长读长overlap搜索。
Q：PCR duplicates必须标记吗？
A：变异检测必须——duplicate导致相同分子的多次测序支持被重复计数，假SNP率飙升。组装不需要标记，duplicates增加覆盖度反而有利。
参考文献
- Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 2009;25(14):1754-1760. DOI: 10.1093/bioinformatics/btp324
- Li H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM. arXiv preprint. 2013;1303.3997. arXiv: 1303.3997