原理
IFA保留细胞自然结构：病毒感染的细胞用4%多聚甲醛固定（交联蛋白保存抗原性），Triton X-100透化使抗体进入。一抗靶向病毒蛋白（如S蛋白、N蛋白），在不同亚细胞位置结合。荧光标记二抗（如Alexa Fluor 488-抗兔IgG）在荧光显微镜特定波长下激发发射。DAPI复染细胞核给出空间参考——可判断病毒蛋白是胞浆/胞核/仍结合在内质网上的。
步骤
1. 细胞爬片与感染
Vero E6细胞种于含盖玻片的24孔板，融合度70%时接种病毒（MOI=0.1-1）。37℃培养至预期时间点（如感染后12/24/36 h）。设未感染对照孔。
2. 固定与透化
吸去培养基，PBS洗2次。4%多聚甲醛（溶于PBS）室温固定15 min——在BLS-3操作至固定完成。PBS洗3×5 min。0.2% Triton X-100/PBS室温透化10 min。PBS洗3×5 min。
3. 封闭与抗体孵育
3% BSA/PBS室温封闭1 h。一抗（抗病毒S蛋白兔多抗1:500于1% BSA/PBS）4℃孵育过夜。次日PBS洗4×5 min。荧光二抗（Alexa Fluor 488-抗兔IgG 1:1000）室温避光孵育1 h。PBS洗4×5 min避光。
4. 封片与成像
含DAPI的封片剂一滴于载玻片，盖玻片细胞面朝下封片，指甲油封边。共聚焦显微镜成像：488 nm通道（绿色，病毒蛋白）、405 nm通道（蓝色，细胞核）。分析病毒蛋白胞内定位和合胞体形成。
关键试剂与条件
| 试剂/耗材 | 规格 | 用量 | 作用 |
|---|---|---|---|
| 4%多聚甲醛 | 16% PFA原液+PBS稀释 | 500 μL/孔 | 细胞固定与病毒灭活 |
| 抗病毒蛋白一抗 | 兔多抗, 1 mg/mL | 1:500 (2 μL/1 mL) | 靶向S蛋白原位检测 |
| Alexa Fluor 488二抗 | 抗兔IgG, 2 mg/mL | 1:1000 | 绿色荧光信号 |
FAQ
Q：IFA和免疫组化（IHC）怎么选？
A：IFA用于培养细胞——荧光信号直接可视化，分辨率高可共聚焦层扫。IHC用于组织切片——石蜡包埋组织做HRP-DAB染色，明场观察。溯源中组织嗜性用IHC，亚细胞定位用IFA。
Q：固定方法影响结果吗？
A：很大。PFA交联固定保持结构最优但可能遮蔽抗原——需透化步骤。甲醇/丙酮沉淀固定穿透好但细胞骨架可能变形。病毒蛋白检测用PFA+0.2% Triton组合最通用。
Q：为什么背景荧光很高？
A：非特异二抗结合——提高封闭浓度（5% BSA+5%正常山羊血清）、降低二抗浓度、加做二抗单独对照（不加一抗）。设透化时间不超过10 min——过度透化增加非特异性。
参考文献
- Riggs JL, Seiwald RJ, Burckhalter JH, et al. Isothiocyanate Compounds as Fluorescent Labeling Agents for Immune Serum. Am J Pathol. 1958;34(6):1081-1097.
- Buchrieser J, Dufloo J, Hubert M, et al. Syncytia formation by SARS-CoV-2-infected cells. EMBO J. 2020;39(23):e106267. DOI: 10.15252/embj.2020106267