血凝与血凝抑制实验（HA/HAI）——病毒血凝滴度测定与血清学检测标准流程

一、原理

流感病毒、副流感病毒包膜上的血凝素蛋白（HA）抓住红细胞表面的唾液酸受体，把红细胞连成网状，孔底出现雾状凝集。特异性抗体先占住 HA，凝集被阻断，红细胞沉成纽扣状。前者是 HA 试验，测病毒凝集力；后者是 HAI 试验，测血清抗体。1941 年 Hirst 用鸡胚尿囊液第一次观察到这个现象，流感血清学从此有了标配工具。

溯源里 HAI 干两件事。拿标准抗血清给分离株定亚型、看抗原漂移，筛出值得送全基因组测序的株。再拿恢复期血清查人群或禽群的既往感染史，给传播链补血清学证据。和微量中和比，HAI 便宜、一天出结果，但不测中和功能，两套数据常一起看。抗原图谱的原始矩阵也来自 HAI。典型做法见在 2009 H1N1 溯源案例中的应用：大流行初期用 HAI 筛各年龄组血清，发现 1950 年前出生的人多数带交叉反应抗体，解释了老年人群感染率偏低。

二、步骤

1. 配红细胞悬液

火鸡或鸡静脉采血入 Alsever 液，4℃ 保存，一周内用完。PBS 洗 3 遍，压积红细胞配成 0.5% 悬液。禽流感病毒用 1% 鸡红细胞。个别 H3N2 变异株不凝集鸡红细胞，换豚鼠或人 O 型红细胞。

2. HA 试验标定 4 HAU

96 孔 V 底板每孔加 25 µL PBS，第 1 列加 25 µL 病毒液（尿囊液或培养上清）倍比稀释。每孔补 25 µL PBS 和 25 µL 红细胞悬液，室温 30 分钟判读。完全凝集的最高稀释度记 1 HAU，倒数是 HA 滴度。工作抗原稀释到 4 HAU/25 µL，回滴必须落在 4、2、1、0.5 HAU 上，不对就重配。

3. 血清预处理

血清 1 份加 RDE（受体破坏酶）3 份，37℃ 过夜，56℃ 30 分钟灭活，终浓度 1:10。跳过这步，非特异性抑制物会把滴度假性抬高。

4. HAI 主试验

板内血清 25 µL 倍比稀释，每孔加 25 µL 4 HAU 抗原，室温放 15 到 30 分钟。加 50 µL 红细胞悬液，室温 30 分钟判读。每板带病毒回滴、红细胞、已知阴阳性血清三组对照。

5. 判读与报告

斜起板子看红细胞流挂。完全凝集孔是雾状，不流挂；完全抑制孔成纽扣，会流挂。HAI 滴度取完全抑制的最高稀释度倒数，同组样品报几何平均滴度（GMT）。差 2 个稀释度（4 倍）才算有意义。就这样。

三、关键试剂与条件

四、FAQ

火鸡红细胞和鸡红细胞怎么选？人、猪流感用 0.5% 火鸡红细胞，禽流感用 1% 鸡红细胞。H3N2 类株不凝集鸡红细胞时，换豚鼠或人 O 型红细胞。

抗原用 4 HAU 还是 8 HAU？4 HAU。8 HAU 会压掉低滴度抗体，回滴对不上 4/2/1/0.5 HAU 就作废。

血清用 RDE 处理还是只热灭活？都要做。只热灭活除不掉 α/β 抑制物，滴度虚高。

参考文献

1. Hirst GK. The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus. Science. 1941;94(2427):22-23. DOI: 10.1126/science.94.2427.22
2. Szretter KJ, Balish AL, Katz JM. Influenza: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. 2006;3(1):Unit 15G.1. DOI: 10.1002/0471729256.mc15g01s3
3. Noah DL, Hill H, Hines D, White EL, Wolff MC. Qualification of the hemagglutination inhibition assay in support of pandemic influenza vaccine licensure. Clin Vaccine Immunol. 2009;16(4):558-566. DOI: 10.1128/CVI.00368-08
4. Kaufmann L, Syedbasha M, Vogt D, et al. An optimized hemagglutination inhibition (HI) assay to quantify influenza-specific antibody titers. J Vis Exp. 2017;(130):55833. DOI: 10.3791/55833