原理
病毒颗粒本身电子密度低，直接上电镜几乎看不见。负染色把重金属盐溶液滴在颗粒表面，把背景和颗粒外围染深。病毒本身保持亮色，轮廓和表面结构像浮雕一样凸出来。核心逻辑是染背景而不是染颗粒，几分钟出图。悬液里病毒浓度低于 10^6 颗粒/mL 时基本检不出，所以培养富集要到位。
溯源工作里，测序给的是核酸序列，电镜给的是颗粒实体的大小、包膜有无、表面突起。两者互相印证，能避免把培养假象当成真病毒。跟超薄切片比，负染色不用固定包埋，半小时出图，适合疫情早期快速初判。1972 年 Kapikian 靠它从诺瓦克镇暴发样本里第一次看见诺如病毒原型，那是暴发溯源经典案例，在「诺瓦克病毒暴发溯源」案例中的应用。
步骤
1. 样本澄清
培养上清先低速离心去掉细胞碎片。粪便、尿液这类临床悬液再过 0.22 µm 滤膜。背景越干净，找颗粒越快。
2. 铜网亲水化
碳支持膜铜网（300-400 目）辉光放电 10-30 秒，表面带上电荷，悬液才铺得开。
3. 吸附
取 10-15 µL 澄清悬液滴到网面，静置 1-5 分钟，滤纸从边缘吸走多余液体。
4. 负染色
网面朝下扣在 2% 磷钨酸染液（pH 7.0）上 30-60 秒。要看包膜细节就换 1% 醋酸铀酰，扣 30 秒。吸干后自然晾干，染液现配现用。
5. 观察
上机电压 80-120 kV，先低倍找颗粒密集区，再放大到 4-8 万倍拍照。低剂量、快操作，别让染料受热起泡。
参数与关键变量
| 试剂/条件 | 规格 | 用量 | 作用 |
|---|---|---|---|
| 磷钨酸（PTA） | 2% 水溶液，pH 6.8-7.0 | 10-15 µL | 常规负染色 |
| 醋酸铀酰（UA） | 1% 水溶液，pH 4.2-4.5 | 10-15 µL | 包膜刺突等精细结构 |
| 碳支持膜铜网 | 300-400 目 | 1 片/样本 | 颗粒吸附载体 |
| 辉光放电 | 10-30 s，10-30 mA | — | 网面亲水化 |
| 0.22 µm 滤膜 | 无菌针头滤器 | 1 个/样本 | 澄清临床悬液 |
FAQ
磷钨酸和醋酸铀酰怎么选？
常规形态鉴定用磷钨酸，中性 pH 不伤颗粒。醋酸铀酰分辨率更高，适合看包膜刺突，但带放射性要走管控。
为什么用负染色而不是超薄切片？
负染色半小时出图，适合筛检和初判。切片看的是病毒在细胞里的位置和内部结构，要做固定包埋，流程以天计。
培养上清和临床粪便哪个更适合负染？
培养上清优先，没别的。粪便悬液必须离心加滤膜，不然杂质盖满视野。诺瓦克病毒原型当年就是从暴发地粪便澄清液里筛出来的。
参考文献
- Brenner S, Horne RW. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 1959;34:103-110. DOI: 10.1016/0006-3002(59)90237-9
- Kapikian AZ, Wyatt RG, Dolin R, Thornhill TS, Kalica AR, Chanock RM. Visualization by immune electron microscopy of a 27-nm particle associated with acute infectious nonbacterial gastroenteritis. J Virol. 1972;10(5):1075-1081. DOI: 10.1128/jvi.10.5.1075-1081.1972
- Harris JR. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 2007;369:107-142. DOI: 10.1007/978-1-59745-294-6_7
- Laue M, Bannert N. Detection limit of negative staining electron microscopy for the diagnosis of bioterrorism-related micro-organisms. J Appl Microbiol. 2010;109(4):1159-1168. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2010.04737.x