原理
病毒颗粒大多 20–200 nm，跟细胞碎片、外泌体、游离核酸挤在一起。要做病毒溯源测序，先得把完整颗粒分出来，不然宿主背景会把有效数据冲淡。超速离心干的就是这件事：几万到几十万 × g 的离心力，让不同密度、不同大小的颗粒各就各位。
差速离心按大小沉降，先低速甩掉细胞残渣，再高速把病毒压成沉淀。密度梯度离心按浮力密度分层，病毒停在 1.3–1.4 g/cm³ 的窄区间。轮状病毒完整（三层）颗粒（TLP）约 1.36 g/cm³，脱壳后的双层颗粒（DLP）约 1.38 g/cm³，跟蛋白碎片（1.3 以下）拉得开。CsCl 梯度里病毒聚成一条肉眼可见的乳白带，就它了。比 PEG 沉淀慢，但去背景干净，下游建库省心。它在溯源里是样本端最关键的质量控制环节，用法见轮状病毒 G9P[8] 溯源案例。
步骤
1. 澄清除菌
样本先低速离心，2,000–10,000 × g、10–30 分钟、4°C，取上清。粪便和污水这类脏样本再过 0.45 μm 或 0.8 μm 滤膜，挡掉细菌碎屑。加 DNase I/RNase A 消化游离核酸，保证后面测的是颗粒内基因组。
2. 浓缩（可选）
体积大就先浓缩。PEG 8000 沉淀或 100 kDa 超滤管都能把体积压到 1–2 mL。培养上清滴度高、体积小，可以直接进梯度。
3. 铺梯度
CsCl 配 1.2、1.4、1.6 g/mL 三层，注射器从高密度到低密度慢慢铺进超速离心管。最上层加样本。蔗糖路线铺 20–60% 线性梯度。经典流程参考 Thurber 的病毒宏基因组制备方案。
4. 超速离心
摆桶转子，100,000–200,000 × g，4°C。CsCl 阶梯梯度 2–4 小时出带，自形成梯度要过夜（16–18 小时）才平衡。轮状病毒带出现在 1.36–1.38 g/cm³ 区间，肉眼可辨。
5. 分带与脱盐
停稳后别急刹车。侧壁穿刺或管底穿洞，按 0.5–1 mL 分批收集，取病毒带。CsCl 会抑制下游酶反应，收集液稀释后用超滤管换液，或再离心一次把病毒压成沉淀。没别的。
关键试剂与条件
| 试剂/耗材 | 规格 | 用量 | 作用 |
|---|---|---|---|
| CsCl | 分子生物学级 | 配 1.2/1.4/1.6 g/mL 三层梯度 | 等密度条带介质，病毒停在 1.3–1.4 g/cm³ |
| 蔗糖 | 20–60% (w/v) | 10–20 mL/管 | 速率区带梯度或垫层，适合保活病毒 |
| OptiPrep（碘克沙醇） | 60% (w/v) | 稀释成 10–40% 梯度 | 低渗惰性介质，包膜病毒回收更好 |
| 滤膜 | 0.45/0.8 μm PES | 1 支/样本 | 去细菌与碎屑，压宿主背景 |
| DNase I/RNase A | 分子生物学级 | 1–2 U/μL | 消化游离核酸，只留颗粒内基因组 |
FAQ
蔗糖梯度与 CsCl 梯度怎么选？
要保感染性（后续接培养或中和实验）用蔗糖；只做核酸测序用 CsCl，条带更锐、收率更稳。
超速离心与 PEG 沉淀浓缩怎么选？
样本体积大、设备紧张用 PEG；样本宝贵、要干净颗粒用超速离心。40,000 × g 的高速离心机也能跑 CsCl 梯度，不一定非超离机不可。
为什么测序前用 CsCl 而不是碘克沙醇？
CsCl 便宜、梯度锐、病毒带窄，核酸损失小。碘克沙醇低渗不伤病毒，但分辨率略差、价格高，留给要活病毒的实验。
参考文献
- Brakke MK. Density gradient centrifugation: a new separation technique. Journal of the American Chemical Society. 1951;73(4):1847-1848. DOI: 10.1021/ja01148a508
- Chen D, Ramig RF. Determinants of rotavirus stability and density during CsCl purification. Virology. 1992;186(1):228-237. DOI: 10.1016/0042-6822(92)90077-3
- Thurber RV, Haynes M, Breitbart M, Wegley L, Rohwer F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 2009;4(4):470-483. DOI: 10.1038/nprot.2009.10
- Conceição-Neto N, Zeller M, Lefrère H, et al. Modular approach to customise sample preparation procedures for viral metagenomics: a reproducible protocol for virome analysis. Scientific Reports. 2015;5:16532. DOI: 10.1038/srep16532