一、原理
中和抗体挡住病毒进入细胞，是评估感染免疫和疫苗效果的关键指标。活病毒中和实验（PRNT）要在 BSL-3 里做，周期长，判读靠人眼数噬斑。
假病毒法换个思路。把目标病毒的刺突糖蛋白（S 蛋白）装配到复制缺陷的骨架病毒上。骨架里塞一个荧光素酶报告基因。抗体中和了，假病毒进不了细胞，发光就弱。没有中和，荧光素酶表达，RLU 就高。发光值降一半对应的血清稀释倍数，就是半数抑制滴度（ID50）。
假病毒只有一轮感染，BSL-2 实验室就能操作，结果由酶标仪读数，比人工判读客观。和 cPass 这类替代中和比，它是细胞水平功能实验，更接近真实感染。和 PRNT 比，快得多，还不用碰活毒。血清中和滴度在溯源里用于确认既往感染、评估变异株免疫逃逸。在新冠病毒血清学溯源中的应用见文末 FAQ。
二、步骤
1. 血清灭活与稀释
血清 56°C 灭活 30 分钟去掉补体。培养基 3 倍梯度稀释，从 1:30 起做 6 个稀释度，设复孔。同时留病毒对照和细胞对照。
2. 假病毒与血清孵育
每孔加固定剂量假病毒，VSV 体系用 650 TCID50/孔，慢病毒体系用约 2×10⁵ RLU/孔。37°C 孵育 1 小时，让抗体和 S 蛋白充分结合。
3. 感染靶细胞
两条路线。慢病毒假病毒：提前一天把 293T-ACE2 按 1.25×10⁴/孔铺好，混合液直接加入。VSV 假病毒：新鲜消化的 Huh7 按 5×10⁴/孔加进混合物。感染后 37°C、5% CO2 培养，VSV 体系 24 小时，慢病毒体系 48–60 小时。
4. 加底物读板
Bright-Glo 底物室温平衡，每孔加与孔内液体等体积的底物（约 100 μL），静置 2 分钟，酶标仪 luminescence 模式读 RLU。
5. 计算 ID50
抑制率按 (1 − 样本 RLU ÷ 病毒对照 RLU) × 100% 算。四参数回归拟合稀释度与抑制率曲线，50% 抑制对应的稀释倍数就是 ID50：
# R: 四参数 log-logistic 拟合
library(drc)
fit <- drm(inhibition ~ log10(dilution), data = df, fct = LL.4())
ED(fit, 50, type = "absolute") # 返回 ID50三、关键试剂与条件
| 试剂/条件 | 规格/用量 | 作用 |
|---|---|---|
| 血清/血浆 | 56°C 30 min；1:30 起 3 倍梯度 ×6，复孔 | 待测中和抗体来源 |
| 假病毒 | VSV 系 650 TCID50/孔；慢病毒系约 2×10⁵ RLU/孔 | 模拟病毒进入 |
| 靶细胞 | 293T-ACE2（慢病毒系）1.25×10⁴/孔；Huh7（VSV 系）5×10⁴/孔 | 受体细胞与报告表达 |
| 病毒血清孵育 | 37°C，1 h | 抗体结合 S 蛋白 |
| 感染后培养 | 37°C、5% CO2；24 h（VSV）或 48–60 h（慢病毒） | 单轮进入并表达荧光素酶 |
| 底物 | Bright-Glo，与孔内液体等体积，室温 2 min | 裂解细胞启动发光 |
| 读数 | 酶标仪 luminescence 模式 | RLU 定量 |
四、FAQ
假病毒中和和活病毒 PRNT 怎么选？
初筛和大样本用假病毒，BSL-2 加 24–60 小时出数。注册申报、关键确证再上 PRNT。
细胞底物用 HEK293T-hACE2 还是 Huh7？
看骨架。慢病毒假病毒配 293T-ACE2，VSV 假病毒配 Huh7。
溯源调查先做 ELISA 结合抗体还是直接上假病毒中和？
大范围初筛用 ELISA，便宜又快。疑似既往感染、要保护性免疫证据时补中和滴度，它跟保护相关性更好。
参考文献
- Nie J, Li Q, Wu J, et al. Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2. Emerg Microbes Infect. 2020;9(1):680-686. DOI: 10.1080/22221751.2020.1743767
- Crawford KHD, Eguia R, Dingens AS, et al. Protocol and Reagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for Neutralization Assays. Viruses. 2020;12(5):513. DOI: 10.3390/v12050513
- Montefiori DC. Evaluating neutralizing antibodies against HIV, SIV, and SHIV in luciferase reporter gene assays. Curr Protoc Immunol. 2004;64(1):12.11.1-12.11.17. DOI: 10.1002/0471142735.im1211s64
- Li Q, Wu J, Nie J, et al. The Impact of Mutations in SARS-CoV-2 Spike on Viral Infectivity and Antigenicity. Cell. 2020;182(5):1284-1294.e9. DOI: 10.1016/j.cell.2020.07.012