原理
病毒溯源要回答两件事：样本里有多少活病毒，测序用的病毒纯不纯。TCID50 和空斑实验就是干这个的。TCID50 是 50% 组织培养感染剂量。样本 10 倍梯度稀释后接种细胞。记录出现细胞病变（CPE）的孔数，用 Reed-Muench 法推出能让半数孔感染的稀释度。结果就是统计滴度，单位 TCID50/mL。
空斑实验思路不同。稀释病毒接种单层细胞，盖上半固体介质。子代病毒只能感染邻旁细胞。感染处细胞死亡，留下一个洞，就是空斑。数空斑直接得感染性颗粒数（PFU/mL）。按泊松分布推算，1 TCID50 约等于 0.69 PFU。空斑还多一个本事：挑单个空斑能拿到单克隆毒株。溯源流程里，这步在 RNA 提取之前。纯化后的单克隆送测序，组装出的基因组才干净。在 SARS-CoV-2 首例美国病例溯源中的应用
步骤
1. 铺细胞
实验前一天把 Vero 或 MDCK 细胞铺进 96 孔板（TCID50 用）或 6 孔板（空斑用）。接种时汇合度 80% 到 90%。细胞状态决定空斑均不均匀。
2. 稀释与接种
上清用无血清 DMEM 做 10 倍梯度稀释，从 10-1 做到 10-8。96 孔板每个稀释度 4 到 8 个复孔，每孔 100 μL。6 孔板每孔 200 μL，37°C 吸附 1 小时，每 15 分钟轻摇一次。设一列不加病毒的阴性对照。
3. 加覆盖层（仅空斑实验）
弃掉接种液，1.2% 琼脂糖与 2× DMEM 等体积混匀，趁热每孔加 2 mL，凝固后倒置培养。嫌加热麻烦就用 Avicel 液体覆盖层（微晶纤维素加羧甲基纤维素钠）。免加热，直接加。
4. 观察与计数
TCID50 每天镜下看 CPE，记各稀释度阳性孔数。终点附近要观察 3 到 7 天。Reed-Muench 公式：lg TCID50 = 高于 50% 阳性率的最高稀释度对数 + 比例距离 × lg10。比例距离 =（高于 50% 的阳性率 − 50%）/（高于 50% 的阳性率 − 低于 50% 的阳性率）。空斑培养 2 到 5 天，加 0.1% 结晶紫（20% 乙醇）染 30 分钟。水冲干净，只数 20 到 200 个空斑的稀释度。
5. 挑斑纯化
枪头从空斑中心挑出琼脂塞，打进 100 μL 无血清 DMEM。冻融一次后感染新细胞，重复 2 到 3 轮得单克隆毒株。挑出的克隆先扩增、再滴定，最后送 RNA 提取和测序。就这样。
参数与关键变量
| 试剂/条件 | 规格/用量 | 作用 |
|---|---|---|
| 宿主细胞 | Vero E6、Vero CCL-81 或 MDCK，汇合度 80–90% | 支持病毒复制的单层细胞 |
| 稀释液 | 无血清 DMEM，10 倍梯度 | 把样本稀释到可数范围 |
| 琼脂糖覆盖层 | 1.2% 琼脂糖与 2× DMEM 1:1 混合 | 限制子代病毒扩散，固定空斑 |
| Avicel 液体覆盖层 | 微晶纤维素 + 羧甲基纤维素钠 | 免加热替代琼脂糖 |
| 染色液 | 0.1% 结晶紫（20% 乙醇），或中性红 | 染色计数空斑 |
| 吸附条件 | 37°C、5% CO2，1 h，每 15 min 轻摇 | 让病毒充分进入细胞 |
FAQ
TCID50 和空斑实验怎么选？
大量样本比滴度，用 TCID50，一块 96 孔板能跑多个样本。要精确滴度或挑单克隆，用空斑实验。两法也能串联：TCID50 粗筛，空斑精标。
测序前为什么做空斑纯化，而不是直接测培养上清？
培养上清可能混着多种基因型，直接测序会得到混合序列。空斑纯化 2 到 3 轮拿到单克隆，测序结果干净。美国首例 COVID-19 病例的流程可以参照（Emerg Infect Dis 2020;26(6):1266-1273）。Vero 细胞分离后 TCID50 标定，第 3、4 代滴度分别是 8.65×106 和 7.65×106 TCID50/mL。空斑实验确认 Vero E6 空斑更清晰。传 4 代后全基因组测序，序列与临床原始株一致。
琼脂糖覆盖层和 Avicel 液体覆盖层怎么选？
琼脂糖要加热，倒板手要快。Avicel 免加热，空斑更清晰，价格高些。热敏感病毒、高等级生物安全实验室，选 Avicel。
参考文献
- Reed LJ, Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Am J Epidemiol. 1938;27(3):493-497. DOI: 10.1093/oxfordjournals.aje.a118408
- Dulbecco R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1952;38(8):747-752. DOI: 10.1073/pnas.38.8.747
- Baer A, Kehn-Hall K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. 2014;(93):e52065. DOI: 10.3791/52065
- Wulff NH, Tzatzaris M, Young PJ. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. J Clin Bioinforma. 2012;2(1):5. DOI: 10.1186/2043-9113-2-5