一、原理
RT-PCR 做病毒核酸快检，绕不开热循环仪和两小时上下的升温降温循环。RT-LAMP 解决的就是这个：整管反应放在 60~65 ℃ 的恒温环境里，20~40 分钟出结果。水浴锅、加热块、车载保温箱都能干。
核心逻辑有两点。一是 Bst 聚合酶有强链置换活性，不需要高温变性来解链。扩增时它边延伸边把前面的双链顶开。二是引物体系识别靶序列上 6~8 个区域，扩增产物自己折叠成哑铃状结构，又充当下一轮循环的模板，滚动放大。一句话说清它跟 RT-PCR 的差别。RT-PCR 靠变温循环扩增，RT-LAMP 靠链置换在恒温下滚动扩增。体系里加入逆转录酶，RNA 病毒的反转录和扩增就在同一个管子里一步完成。
在溯源链条里，RT-LAMP 的定位是前端快筛。暴发点、低资源地区的阳性初判靠它，阳性样本再送 Sanger 或 NGS 测序定谱系。这套「先筛后测」的打法，在 SARS-CoV-2 溯源筛查中的应用 里体现得最典型。
二、步骤
1. 引物设计
选病毒基因组的保守区段做靶标，比如 SARS-CoV-2 的 N、M 或 ORF1ab 区域。用 PrimerExplorer 或 NEB LAMP Primer Design Tool 设计 6 条引物：外引物 F3/B3、内引物 FIP/BIP、环引物 LF/LB。引物务必错开变异热点位点，免得某个变异株漏检。
2. 配反应体系
25 μL 体系：WarmStart LAMP 2X Master Mix 取 12.5 μL，它已经把 Bst 2.0 WarmStart 聚合酶和 WarmStart RTx 逆转录酶配好了。再加引物混合液、荧光染料、模板 RNA，补水到 25 μL。WarmStart 技术让酶在室温不干活，开盖配样时不容易非特异扩增。
3. 恒温扩增
65 ℃ 孵育 20~40 分钟。没有荧光仪就用加热块或水浴，结束后再判读；有实时荧光仪就边扩增边看曲线。
4. 结果判读
三种读法任选：荧光曲线起峰且起峰时间早于阈值、浊度上升（焦磷酸镁沉淀）、酚红 pH 指示剂由粉红变黄。每批带上阳性对照和 NTC。NTC 起峰说明有污染或错扩增，整批重做。
5. 阳性样本送测序溯源
阳性管里的扩增产物不用再富集。直接 Sanger 测序看关键突变位点，或转入 NGS 流程做全基因组定谱系。2020 年 Dao Thi 团队的做法就是比色 RT-LAMP 初筛、LAMP 产物测序复核。快筛和溯源，就这么接上了。
三、关键参数
| 试剂/条件 | 规格 | 用量（25 μL 体系） | 作用 |
|---|---|---|---|
| WarmStart LAMP 2X Master Mix | 2×（Bst 2.0 + RTx） | 12.5 μL | 链置换扩增 + 逆转录 |
| FIP/BIP 内引物 | 10× 工作液 | 终浓度 1.6 μM | 启动哑铃结构形成 |
| F3/B3 外引物 | 10× 工作液 | 终浓度 0.2 μM | 起始链置换 |
| LF/LB 环引物 | 10× 工作液 | 终浓度 0.4 μM | 加速扩增，缩短出峰时间 |
| LAMP 荧光染料 | 50× | 0.5 μL | 实时荧光监测 |
| 模板 RNA | 提取 RNA 或拭子粗裂解液 | 2~5 μL | 检测靶标 |
| 反应温度 / 时间 | 65 ℃ | 20~40 min | 等温扩增窗口 |
四、FAQ
RT-LAMP 和 RT-qPCR 怎么选？
现场快筛、设备受限、要 1 小时内出结果，选 RT-LAMP；要做定量、出合规检测报告，选 RT-qPCR。两者常搭配：LAMP 初筛，qPCR 复核。
为什么用 Bst 聚合酶而不是 Taq？
Taq 没有链置换活性，必须靠反复升温变性来解链。Bst 自带链置换，恒温下就能滚动扩增，这是 LAMP 不用热循环仪的根子。
6 条引物和 5 条引物体系怎么选？
6 条更快更灵敏，错扩增引起的假阳性风险也更高。5 条牺牲一点速度换特异性。大批量筛查、对假阳性敏感的场景选 5 条。没别的。
参考文献
- Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):e63. DOI: 10.1093/nar/28.12.e63
- Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002;16(3):223-229. DOI: 10.1006/mcpr.2002.0415
- Dao Thi VL, Herbst K, Boerner K, et al. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples. Sci Transl Med. 2020;12(556):eabc7075. DOI: 10.1126/scitranslmed.abc7075
- Thai HTC, Le MQ, Vuong CD, et al. Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 2004;42(5):1956-1961. DOI: 10.1128/JCM.42.5.1956-1961.2004