原理
Western blot是分子量分辨率最高的蛋白检测方法。病毒裂解液经SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）按分子量分离蛋白——小蛋白迁移快、大蛋白迁移慢。电泳后电转至PVDF膜，经封闭、一抗（抗病毒蛋白，如抗N蛋白单抗）孵育、酶标二抗孵育、化学发光底物（ECL）显色。目标条带出现在预期分子量位置，X光胶片或CCD成像系统采集信号。
步骤
1. SDS-PAGE电泳
制备10%分离胶和5%浓缩胶。病毒裂解液加5×上样缓冲液（含β-巯基乙醇），95℃煮5 min变性。每孔上样10-30 μg总蛋白和预染Marker。180V电泳约45 min至溴酚蓝指示带走至胶底。
2. 湿式转膜
PVDF膜先用甲醇活化30秒，转入转膜缓冲液平衡。按海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵「三明治」组装。300 mA恒流2 h湿转，冰浴降温。转膜后丽春红染色确认蛋白转移效率。
3. 封闭与抗体孵育
5%脱脂奶（TBST配制）室温封闭1 h。一抗（抗病毒NP蛋白兔多抗1:2000稀释）4℃孵育过夜。TBST洗3×10 min。HRP-抗兔IgG二抗（1:5000）室温孵育1 h，TBST洗3×10 min。
4. ECL显色与分析
ECL底物（等体积A/B液混合）覆盖膜表面，孵育2 min。化学发光成像系统曝光（0.5-5 min），分析条带分子量与预期蛋白（如SARS-CoV-2 N蛋白~46 kDa）匹配位置。Presence/absence判定阳/阴性。
关键试剂与条件
| 试剂/耗材 | 规格 | 用量 | 作用 |
|---|---|---|---|
| PVDF膜 | 0.45 μm孔径 | 1张/胶 | 蛋白转移固体支持 |
| 抗病毒NP蛋白一抗 | 兔多抗, 1 mg/mL | 1:2000 (5 μL/10 mL) | 靶向病毒核蛋白检测 |
| ECL底物 | SuperSignal West Pico | ~1 mL/膜 | HRP化学发光底物 |
FAQ
Q：Western blot和ELISA确证有什么不同？
A：ELISA检测结合活性——只要有结合就有信号，可能交叉反应导致假阳。Western blot加了一条分子量维度——抗体不仅需要结合，还需结合在正确分子量位置的蛋白，特异性远高于ELISA。HIV确证标准就是WB阳性。
Q：为什么选PVDF膜而不是NC膜？
A：PVDF结合容量高、机械强度好、可多次stripping和reprobe。NC膜结合容量低、易碎但背景极低——做低丰度病毒蛋白时NC可能更干净。
Q：没有清晰的条带怎么办？
A：四步排查：① 蛋白量不足（上样量增至50 μg）；② 一抗特异性差（换另一靶位抗体）；③ 转膜不充分（延长至3 h或降电流到200 mA过夜）；④ 病毒蛋白是否表达在被检测的裂解液中（用阳性对照病毒裂解液验证）。
参考文献
- Laemmli UK. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-685. DOI: 10.1038/227680a0
- Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Proc Natl Acad Sci USA. 1979;76(9):4350-4354. DOI: 10.1073/pnas.76.9.4350