原理
中和实验直接测定血清中抗体的生物功能——阻断病毒进入宿主细胞的能力。血清经56℃ 30 min热灭活去除补体活性后，从1:10起做2倍系列稀释。每稀释度与固定剂量病毒（通常100 TCID50）混合，37℃孵育1 h让抗体充分中和。混合液接种至敏感细胞单层，培养3-7天直至病毒对照孔出现100%细胞病变效应（CPE）。NT50=中和50%病毒感染的血清最高稀释倍数。
步骤
1. 病毒滴度测定（TCID50滴定）
在96孔板中做病毒10倍系列稀释（10⁻¹至10⁻⁸），每稀释度8复孔接种Vero E6细胞。37℃ 5% CO₂培养，每日观察CPE。Day 4-7用Reed-Muench法计算TCID50/mL——使50%细胞孔感染的病毒稀释度的倒数。
2. 血清稀释与病毒中和
热灭活血清从1:10开始做2倍梯度稀释（1:10至1:1280）。每稀释度取50 μL与50 μL含100 TCID50的病毒液混合（96孔U底板），37℃孵育1 h。设病毒对照（仅有病毒，无血清）和细胞对照（仅有培养基，无病毒+无血清）。
3. 接种与培养
将血清-病毒混合物转移至含Vero E6单层细胞的96孔平底板，每孔100 μL。37℃ 5% CO₂培养3-7天。每天显微镜下观察CPE（细胞变圆、脱落、融合）并记录。
4. CPE判读与NT50计算
病毒对照孔100% CPE出现后，逐一记录每稀释度的CPE孔数。用Reed-Muench法计算NT50——两稀释度间内插。报告格式：NT50 = 1:160（例如）。平行测试WHO国际标准血清做阳性对照。
关键试剂与条件
| 试剂/耗材 | 规格 | 用量 | 作用 |
|---|---|---|---|
| Vero E6细胞 | ACE2高表达, 第5-20代 | 2×10⁴/孔 | 病毒敏感细胞系 |
| DMEM+2% FBS | 含抗生素 | 100 μL/孔 | 维持培养液 |
| 病毒原液 | 已知TCID50滴度 | 稀释至100 TCID50/50 μL | 中和实验攻击剂量 |
FAQ
Q：中和实验和假病毒中和实验怎么选？
A：活病毒中和实验是金标准但需BLS-3实验室。假病毒（VSV-G或HIV骨架）包被目标病毒S蛋白，可在BLS-2下操作。假病毒结果与活病毒相关性>0.85，高通量筛查可用假病毒做初筛。
Q：NT50和ELISA抗体OD值有什么关系？
A：相关但非线性。ELISA检测结合抗体（总抗RBD IgG），中和实验检测功能性抗体。结合抗体多时中和活性概率高，但结合抗体中约30-70%为非中和抗体。
Q：NT50≥多少才算有保护力？
A：无统一标准。SARS-CoV-2研究提示NT50≥1:40-1:80可提供>50%保护效果（基于突破感染数据）。不同病毒差异很大——流感HAI≥1:40、RSV中和≥1:100。
参考文献
- Reed LJ, Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Am J Epidemiol. 1938;27(3):493-497. DOI: 10.1093/oxfordjournals.aje.a118408
- Muruato AE, Fontes-Garfias CR, et al. A high-throughput neutralizing antibody assay for COVID-19 diagnosis and vaccine evaluation. Nat Commun. 2020;11:4059. DOI: 10.1038/s41467-020-17892-0