原理
ELISA间接法是最经典的抗体检测模式。病毒抗原预先固定于96孔板底表面（物理吸附），加入待检血清孵育——特异性抗病毒抗体（一抗）与抗原结合。洗涤去除未结合成分后加入酶标二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗人IgG），再次洗涤后加TMB（四甲基联苯胺）底物。HRP催化TMB显蓝色，加酸终止变黄色，OD450值与抗体浓度成正比。
步骤
1. 抗原包被
用碳酸盐缓冲液（pH 9.6）将纯化病毒抗原稀释至1-5 μg/mL，每孔加100 μL，4℃包被过夜（或37℃ 2 h）。次日PBST洗涤3次，每孔加200 μL封闭液（3% BSA/PBS），37℃封闭1 h。
2. 血清孵育
待检血清用封闭液1:100稀释（起始筛查稀释度），每孔100 μL，设阴性对照（预筛选的阴性血清）和空白对照（仅封闭液）。37℃孵育1 h，PBST洗涤4次——每次浸泡30秒，彻底去除未结抗体。
3. 二抗与显色
加HRP标记的抗人IgG（或IgM）二抗（封闭液稀释，通常1:5000-1:20000），37℃孵育1 h。PBST洗涤4次。每孔加100 μL TMB底物液，室温避光孵育15-20 min——阳性孔显蓝色梯度。
4. 终止读板与判读
加50 μL 2M H₂SO₄终止反应（蓝色→黄色），酶标仪读OD450。Cutoff=阴性对照均值+3×SD。OD>cutoff为阳性，OD/cutoff (S/CO)>1.0判阳。滴度测定做系列稀释（1:100, 1:200, 1:400...1:25600），终点=OD落入cutoff范围的最高稀释度。
关键试剂与条件
| 试剂/耗材 | 规格 | 用量 | 作用 |
|---|---|---|---|
| 高吸附ELISA板 | 96孔, 平底, MaxiSorp | 1板/96样本 | 抗原包被载体 |
| HRP-抗人IgG | 1 mg/mL, Fc特异性 | 100 μL/孔 (1:10000) | 检测结合抗体 |
| TMB底物液 | 单组分, 即用 | 100 μL/孔 | 酶显色 |
FAQ
Q：间接法和夹心法ELISA怎么选？
A：间接法检测血清抗体——抗原在下、血清在中间、酶标二抗在上。夹心法检测抗原——捕获抗体在下、样本在中、检测抗体在上。病毒溯源抗体筛查用间接法，抗原检测用夹心法。
Q：OD背景高怎么办？
A：三个来源：① 封闭不充分——加严封闭条件（5%脱脂奶或延长至2 h）；② 二抗浓度过高——梯度稀释试最佳稀释；③ 洗涤不够——PBST加0.1% Tween-20，洗涤次数增至6次。
Q：1:100筛查阴性需要再测吗？
A：1:100阴性通常不再稀释。但如临床高度怀疑（症状典型+核酸阳性）可做1:10或1:50再测——极早期感染（<7>
参考文献
- Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 1971;8(9):871-874. DOI: 10.1016/0019-2791(71)90454-X
- Amanat F, Stadlbauer D, Strohmeier S, et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nat Med. 2020;26(7):1033-1036. DOI: 10.1038/s41591-020-0913-5