原理
TempEst对导入的ML树做root-to-tip回归：以最古老序列为根，计算每个序列到根的遗传距离（替代/位点），然后线性回归遗传距离~采样日期。正的斜率=进化速率估值（替代/位点/年），R²>0.3通常视为足够时间信号支持分子钟分析。回归残差>2 SD的序列被标记为时间异常——可能是元数据错误、重组或非同义选择所致。
步骤
1. 准备输入文件
需要一个已建好的ML树（Newick格式，用IQ-TREE/RAxML生成）和一个采样日期表。日期表为tab分隔格式：序列名\t日期（如2019-12-15，或小数年2019.96）。
2. 加载数据与最佳根选择
tempest --tree ML_tree.nwk --dates dates.txt --output tempest_results
TempEst自动优化根的位置找到R²最大的回归。也可手动指定根序列。
3. 评估结果
检查三项：① R²和相关系数——>0.3合格，<0>|2|的序列，逐一排查元数据错误。
4. 处理异常序列
对离群点：① 核实原始采样日期（常有录入错误）；② BLAST验证序列身份（是否交叉污染）；③ 检查是否经历了非同义选择压力（dN/dS异常高）。纠正后再跑TempEst验证。
参数选择建议
| 参数 | 推荐值 | 说明 |
|---|---|---|
| Best-fitting root | 开启（默认） | 自动搜索R²最优根 |
| 残差阈值 | 2 SD | 离群点检测严格度，可调至1.5 SD |
| 日期格式 | 小数年（2024.52） | 最高精度，支持YYYY-MM-DD |
FAQ
Q：R²很低（<0>
A：不建议。低R²提示时间信号极弱——突变饱和或采样窗口太窄（<3>
Q：离群点一定要删吗？
A：不删。先查原因——录入错误纠正即可。重组序列必须排除（重组破坏分子钟假设）。非同义选择压力大的序列可保留但在BEAST中设不同分区模型。
Q：TempEst找不到最佳根怎么办？
A：手动指定——挑选采样最早且不在极长枝上的序列为根。BEAST运行时会coupled根，但TempEst需要固定根做回归。选错根会导致R²虚低。
参考文献
- Rambaut A, Lam TT, Max Carvalho L, et al. Exploring the temporal structure of heterochronous sequences using TempEst. Virus Evol. 2016;2(1):vew007. DOI: 10.1093/ve/vew007
- Duchene S, Duchene D, Holmes EC, et al. The Performance of the Date-Randomization Test in Phylogenetic Analyses of Time-Structured Virus Data. Mol Biol Evol. 2015;32(7):1895-1906. DOI: 10.1093/molbev/msv056