原理
MiSeq基于桥式PCR扩增和可逆终止子边合成边测序（SBS）。文库分子经NaOH变性为单链后注入流动槽（Flow Cell），单链分子的P5/P7接头与槽面寡核苷酸互补杂交，经桥式PCR形成单分子克隆簇。SBS每循环掺入荧光标记dNTP（四种碱基各一色），激光激发成像记录碱基信息后切除终止基团和荧光标签，进入下一循环。双端测序时Flip-turn反转簇方向读取Read 2。
步骤
1. 文库变性稀释
用0.2 N NaOH将文库变性为单链5 min，HT1缓冲液稀释至10-12 pM。混入1% PhiX对照文库（碱基平衡内参）。MiSeq v3试剂盒推荐上样600 μL、终浓度10 pM。
2. 上机启动
装载MiSeq Reagent Cartridge（预装SBS试剂）和Flow Cell，在MiSeq Control Software中设置参数：双端测序，Read 1 301 bp，Index 1/2各8 bp，Read 2 301 bp。运行前预热激光系统15 min。
3. 测序运行
全程自动化，2×300 bp约需56小时。机器自动完成簇生成→边合成边测序→碱基判读（Base Calling）→FASTQ生成。可在Local Run Manager或BaseSpace实时监控Q30和簇密度。
4. 数据交付
测序完成后自动生成FASTQ.gz文件，含Undetermined（无法匹配Index的reads）。检验关键QC指标：Q30>75%、簇密度800-1200 K/mm²、reads通过率>80%。
参数选择建议
| 参数 | 推荐值 | 说明 |
|---|---|---|
| 上样浓度 | 10-12 pM | 过高导致簇重叠，过低产率不足 |
| PhiX掺入比例 | 1-5% | 低多样性文库（扩增子）加5% |
| 读长配置 | 2×150 bp或2×300 bp | 病毒基因组<30> |
FAQ
Q：MiSeq和NextSeq怎么选？
A：MiSeq适合小项目和验证（15 Gb/run, ~25M reads），NextSeq适合群体水平（120 Gb/run, ~400M reads）。病毒基因组测序（<30>
Q：PhiX为什么必须加？
A：扩增子文库碱基组成偏向会导致簇定位失败。PhiX提供>45% GC的平衡碱基分布，校正色标矩阵。不加PhiX的低多样性文库Q30可能骤降至<50>
Q：2×150和2×300 bp哪个好？
A：2×150 bp读长短但质量高（Q30>85%），适合基因分型和SNP检测。2×300 bp读长更长、覆盖更多的病毒基因组结构变异，但Q30略低（~75%）。全基因组组装优先2×300 bp。
参考文献
- Bentley DR, Balasubramanian S, Swerdlow HP, et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 2008;456(7218):53-59. DOI: 10.1038/nature07517
- Quail MA, Smith M, Coupland P, et al. A tale of three next generation sequencing platforms. BMC Genomics. 2012;13:341. DOI: 10.1186/1471-2164-13-341