原理
Nanopore测序核心是嵌入高分子膜的纳米孔蛋白（CsgG突变体）。当单链DNA在驱动蛋白（Motor Protein）作用下匀速穿过纳米孔时，不同碱基组合引起特征性的离子电流变化，由膜两侧的Ag/AgCl电极实时记录。电流信号经神经网络模型（Guppy）解码为碱基序列。由于无合成步骤、无Phasing/Pre-phasing误差，读长仅受DNA分子长度限制。
步骤
1. 文库制备
取200 fmol纯化病毒DNA（>30 kb优先），NEBNext FFPE Repair Mix+Ultra II End Repair+dA-tailing做末端修复+A尾。用Ligation Sequencing Kit中的LNB连接测序接头（含Motor Protein和胆固醇系留锚），SFB磁珠纯化。
2. Flow Cell准备与上样
MinKNOW软件执行Flow Cell Check确认有效孔>800。Flush Buffer冲洗存储液后，Flow Cell Loading Beads预混文库，SpotON口上样。文库经胆固醇锚嵌入膜后Motor Protein开始牵引入孔。
3. 实时测序与监控
MinKNOW实时显示测序进度、通过孔数和N50。可按需启用自适应采样（Adaptive Sampling）排除宿主reads富集病毒reads。测序中可按需提前停止——数据量够即终止，无需等Flow Cell耗尽。
4. 碱基识别与分析
原始信号（pod5/fast5）经Guppy high-accuracy模式下转换为FASTQ。质量控制用NanoPlot，过滤Q<10>100×加上短读长polishing可将准确率提升至Q50+。
参数选择建议
| 参数 | 推荐值 | 说明 |
|---|---|---|
| 碱基识别模式 | HAC (High Accuracy) | 速度略慢但Q值显著优于Fast模式 |
| 条形码方案 | Native Barcoding 96 | 最多24样本混样上机 |
| 组装软件 | Flye (meta模式) | 长读长病毒基因组组装首选 |
FAQ
Q：Nanopore和Illumina哪个准确率更高？
A：Illumina原始Q30>75%（>99.9%准确率），Nanopore单分子准确率约Q15-20（~97-99%）。但Nanopore长读长可跨越重复区完成de novo组装，加上一致性矫正可达到>Q50。两者互补——短读长做SNP识别，长读长做全基因组结构。
Q：DNA片段短会影响产出吗？
A：会。Nanopore优先测长片段（>1 kb），短片段（<500>2 kb即可高效测序。
Q：Flow Cell可以重复使用吗？
A：可以。测序后立即用Nuclease Flush洗涤残留文库，存储于Storage Buffer中4℃。重复使用后可用孔数下降~20-30%/次，不建议超过3次。
参考文献
- Jain M, Olsen HE, Paten B, et al. The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community. Genome Biol. 2016;17:239. DOI: 10.1186/s13059-016-1103-0
- Quick J, Loman NJ, Duraffour S, et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 2016;530(7589):228-232. DOI: 10.1038/nature16996