原理
10x Chromium微流控以约65%的单细胞捕获率将细胞和凝胶珠封装入GEM（Gel Bead-in-Emulsion）。每个凝胶珠携带约750000条含相同10x Cell Barcode+UMI的引物。GEM内裂解细胞后反转录，cDNA共享同一Cell Barcode标识细胞来源、UMI标识分子来源。破乳回收cDNA扩增后酶切片段化，加P5/P7接头完成3'基因表达文库。
步骤
1. 单细胞悬液制备
病毒感染后指定时间点消化细胞，过40 μm细胞筛，台盼蓝染色计数。活力>90%方可用于微流控。用PBS+0.04% BSA重悬至700-1200 cells/μL。
2. GEM生成与反转录
将细胞悬液、凝胶珠、油相依次加入Chromium芯片，上机生成GEM（约6 min/样本）。GEM收集后运行RT程序：53℃ 45 min→85℃ 5 min。每个GEM微反应器约100 pL，含完整RT体系。
3. cDNA扩增与质控
破乳后用Silane Dynabeads纯化cDNA，PCR扩增12-14循环。Qubit和Bioanalyzer质控：浓度>1 ng/μL，片段范围500-5000 bp，主峰~1500 bp。
4. 文库构建与测序
取100 pg cDNA做片段化→末端修复→加A→连接Read 2 Adaptor。Sample Index PCR引入i7 Index和P5/P7。最终文库约300-600 bp，NextSeq或NovaSeq PE150测序。
关键试剂与条件
| 试剂/耗材 | 规格 | 用量 | 作用 |
|---|---|---|---|
| Gel Beads v3.1 | 含Cell Barcode+UMI+poly(dT)引物 | 1条/样本 | 单细胞RNA条形码标记 |
| Chromium Chip G | 8通道微流控芯片 | 1张/8样本 | GEM生成 |
| Silane Dynabeads | 链霉亲和素修饰 | 40 μL/样本 | cDNA纯化 |
FAQ
Q：细胞活力低于90%怎么办？
A：死细胞释放的游离mRNA会被封装入GEM产生背景噪音。可用Dead Cell Removal Kit（Miltenyi）磁选去除死细胞，或通过后续生信分析用线粒体reads比例过滤死细胞。
Q：病毒mRNA能检测到吗？
A：标准的poly(dT)富集可检测到病毒polyA尾mRNA（如冠状病毒）。无polyA尾的病毒RNA需用探针捕获或定制含病毒特异性引物的凝胶珠。
Q：多少个细胞上机合适？
A：目标回收3000-8000细胞/样本，上样10000。实际回收率约65%。过多细胞导致双细胞率上升（>5%），过少影响统计功效。
参考文献
- Zheng GX, Terry JM, Belgrader P, et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 2017;8:14049. DOI: 10.1038/ncomms14049
- Wyler E, Mösbauer K, Franke V, et al. Transcriptomic profiling of SARS-CoV-2 infected human cell lines identifies HSP90 as target for COVID-19 therapy. iScience. 2021;24(3):102151. DOI: 10.1016/j.isci.2021.102151