原理
扩增子建库采用两轮PCR策略：第一轮PCR用靶向引物扩增目标区域，引物5'端携带Illumina Overhang序列（Read 1/Read 2 adapter）；第二轮PCR用双Index引物对Overhang序列退火，引入i5/i7条形码和P5/P7流式细胞结合序列。该设计将靶向引物设计难度降至最低，且多靶点可用同一套Index引物完成。
步骤
1. 一轮PCR（靶向扩增）
设计含Overhang的靶向引物：正向F=Read1_adapter+gene_specific_F，反向R=Read2_adapter+gene_specific_R。PCR体系：12.5 μL Q5 Master Mix、各1 μL引物（10 μM）、5-10 ng模板DNA，补水至25 μL。程序：98℃ 30 s→25 cycles (98℃ 10 s, 退火温度优化 30 s, 72℃ 30 s)→72℃ 2 min。
2. 一轮纯化
AMPure XP磁珠1.0×纯化PCR产物，去除引物二聚体。洗脱于25 μL TE。
3. 二轮PCR（加Index）
取5 μL一轮纯化产物，加入Nextera Index 1/2各2.5 μL和12.5 μL Q5 Master Mix，补水至25 μL。扩增8个循环。Index组合确保每样本唯一条形码。
4. 最终纯化与定量
1.0×磁珠纯化后Qubit定量，等摩尔混合文库。Bioanalyzer验证片段长度（靶向产物+~70 bp接头=预期范围）。
关键试剂与条件
| 试剂/耗材 | 规格 | 用量 | 作用 |
|---|---|---|---|
| Q5 2X Master Mix | NEB M0492S, 高保真DNA聚合酶 | 12.5 μL/反应 | 靶向扩增 |
| 靶向引物对 | 10 μM, HPLC纯化, 含Overhang | 各1 μL | 一轮特异性扩增 |
| Nextera Index组合 | i5+i7, 384种组合 | 各2.5 μL | 样本条形码 |
FAQ
Q：一轮PCR循环数选多少？
A：以最少的循环获得足够产物为原则——凝胶可见弱带通常25循环足够。过量循环导致嵌合体序列激增（>30%），后患远大于低浓度。扩增子库循环数绝不超过30。
Q：多重PCR引物怎么设计？
A：使用Primer3或Primal Scheme设计tiling引物，每对产物400-600 bp，Tm误差±2℃以内。所有引物池混后用同条件PCR——不逐对优化，保证各扩增子的均匀性。
Q：一轮后需要跑胶验证吗？
A：强烈建议。一轮产物可见预期大小单一条带说明特异性良好。若出现杂带或涂抹带，应先优化退火温度（梯度PCR）再继续建库。
参考文献
- Klindworth A, Pruesse E, Schweer T, et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 2013;41(1):e1. DOI: 10.1093/nar/gks808
- Quick J, Loman NJ, Duraffour S, et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 2016;530(7589):228-232. DOI: 10.1038/nature16996