原理
T4 DNA连接酶法建库遵循末端修复→加A→连接→扩增的标准四步流程。机械或酶切打断的DNA片段末端需先经T4 DNA聚合酶和T4 PNK修复为平末端并5'磷酸化，再由Klenow exo-在3'端添加单个dATP形成突出A尾，最后T4 DNA连接酶催化接头T尾与A尾互补连接。连接后的接头含P5/P7流式细胞结合序列和Index条形码，完成文库即上机。
步骤
1. 末端修复与加A尾
将片段化DNA（100-500 ng，~200-400 bp）加入End Prep Enzyme Mix和Buffer，运行：20℃ 30 min→65℃ 30 min。前半段T4 DNA Pol填充5'突出、切除3'突出；后半段Klenow exo-加dA尾。
2. 接头连接
向反应中加入Ligation Enhancer、Blunt/TA Ligase Master Mix和稀释后的NEBNext Adaptor（1.5 μM），20℃孵育15 min。加入USER Enzyme切除接头环区，37℃ 15 min。
3. 磁珠纯化
用AMPure XP磁珠（0.9×体积）纯化连接产物，去除游离接头二聚体。70%乙醇洗涤两次，洗脱于15 μL TE。
4. 文库扩增
加入Index引物和Q5 Master Mix，PCR：98℃ 30 s→8 cycles (98℃ 10 s, 65℃ 75 s)→65℃ 5 min。用0.9×磁珠再次纯化，Qubit定量。
关键试剂与条件
| 试剂/耗材 | 规格 | 用量 | 作用 |
|---|---|---|---|
| End Prep Enzyme Mix | 含T4 DNA Pol+T4 PNK+Klenow exo- | 3 μL/样本 | 末端修复+加A |
| Blunt/TA Ligase Master Mix | 含T4 DNA连接酶 | 15 μL/样本 | T-A连接 |
| NEBNext Adaptor | 15 μM存储液, 稀释至1.5 μM | 2.5 μL/样本 | 测序接头 |
FAQ
Q：T4连接酶法和Nextera转座酶法怎么选？
A：T4连接酶法需要100-500 ng输入，Nextera只需1 ng。但T4法片段覆盖更均匀，无转座酶切割偏好性。大基因组（>1 Mb）和需高均一性覆盖的场景用T4法；微量病毒样本（<10>
Q：接头二聚体怎么避免？
A：接头浓度过高是主因。最佳终浓度0.15-0.5 μM。磁珠纯化用0.9×体积可选择去除<150>5%，增加一次1.0×磁珠纯化。
Q：为什么连接后要用USER酶处理？
A：NEBNext接头含U碱基环区结构，USER（Uracil-Specific Excision Reagent）切除U碱基打开环区，寡核苷酸链分离为可扩增的单链模板。不处理会导致Q5聚合酶在环区阻断。
参考文献
- Fisher S, Barry A, Abreu J, et al. A scalable, fully automated process for construction of sequence-ready human exome targeted capture libraries. Genome Biol. 2011;12(1):R1. DOI: 10.1186/gb-2011-12-1-r1
- Head SR, Komori HK, LaMere SA, et al. Library construction for next-generation sequencing: Overviews and challenges. Biotechniques. 2014;56(2):61-77. DOI: 10.2144/000114133