原理
Nextera XT转座酶建库的核心是Tagmentation——转座酶Tn5包裹两段含适配子序列的DNA寡核苷酸，在Mg²⁺存在下随机切割DNA并同时将接头序列共价连接到断点两端。这一"切+连"二合一反应将传统建库的机械打断+末端修复+A尾+接头连接四步压缩为一步，大幅减少样本损耗和操作时间。
步骤
1. Tagmentation片段化
取1 ng纯化病毒DNA（或cDNA），加入10 μL Tagment DNA Buffer和5 μL Amplicon Tagment Mix，55℃孵育5 min。立即加入5 μL Neutralize Tagment Buffer终止反应。
2. 文库扩增
向终止后的反应中加入15 μL NPM和5 μL Index引物（i5+i7各2.5 μL），运行PCR：72℃ 3 min→95℃ 30 s→12 cycles (95℃ 10 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s)→72℃ 5 min。Index引入样本特异条形码和P5/P7流式细胞结合序列。
3. 纯化
用AMPure XP磁珠（0.6×体积）纯化PCR产物，去除引物二聚体和短片段（<100>
4. 质控与定量
用Agilent Bioanalyzer或Qubit测定文库浓度和片段分布。理想文库片段范围200-800 bp，主峰~400 bp。浓度>2 nM即可上机。
关键试剂与条件
| 试剂/耗材 | 规格 | 用量 | 作用 |
|---|---|---|---|
| ATM (Amplicon Tagment Mix) | 含Tn5转座酶-接头复合物 | 5 μL/样本 | 片段化+接头连接 |
| AMPure XP磁珠 | 羧基修饰超顺磁珠 | 30 μL/样本（0.6×） | 文库纯化选择 |
| Index引物对 | i5/i7组合，96种 | 各2.5 μL | 样本条形码+P5/P7 |
FAQ
Q：Nextera XT和常规机械打断建库怎么选？
A：Nextera XT适合小基因组/扩增子，输入1 ng、操作~2h。机械打断适合大基因组和需要均匀覆盖的场景，输入100 ng+但断裂位点更随机。病毒基因组（<200>
Q：PCR循环数选多少？
A：1 ng输入默认12循环。不足1 ng增至15循环、过量（10-50 ng）降至8-10循环。循环数过多会导致PCR duplicates急剧增加（>30%），许多软件会将其标记为duplicate后丢弃。
Q：磁珠比例0.6×和1.0×有什么区别？
A：0.6×去除<200>500 bp长片段。1.0×保留>150 bp。Nextera XT推荐0.6×去除游离Index引物（~60 bp）。
参考文献
- Caruccio N. Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology. Methods Mol Biol. 2011;733:241-255. DOI: 10.1007/978-1-61779-089-8_17
- Quick J, Grubaugh ND, Pullan ST, et al. Multiplex PCR method for MinION and Illumina sequencing of Zika virus. Nat Protoc. 2017;12(6):1261-1276. DOI: 10.1038/nprot.2017.066