原理
Trizol法基于Chomczynski和Sacchi 1987年建立的酸性酚-氯仿一步抽提原理。Trizol试剂含异硫氰酸胍（强蛋白变性剂）和酸性酚。加入氯仿后分相：RNA因磷酸骨架在酸性条件下保持负电荷留在上层水相，DNA和蛋白分别被分配至中层界面和下层有机相。上层水相经异丙醇沉淀回收RNA。该方法可同时提取RNA和DNA，是病毒培养上清中高纯度RNA提取的金标准。
步骤
1. 裂解与分相
250 μL病毒培养上清加入750 μL Trizol，吹打混匀，室温静置5 min。加入200 μL氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置2-3 min。氯仿提取蛋白质和脂质同时促进相分离。
2. 离心分相
12000 g、4℃离心15 min。离心后可见三层：上层无色水相（含RNA，约400 μL），中层白色界面（DNA和蛋白），下层粉红色有机相（氯仿-酚）。小心吸取上层水相约350-400 μL至新管，避免触碰中层。
3. 沉淀
加入等体积异丙醇（约400 μL）和1 μL糖原（Glycogen，20 mg/mL）作为共沉淀剂，颠倒混匀，-20℃静置30 min或过夜。12000 g、4℃离心15 min，管底可见白色RNA沉淀。
4. 洗涤与溶解
弃上清，加入1 mL 75%乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀。7500 g、4℃离心5 min，弃乙醇，开盖晾干5-10 min。用20-50 μL DEPC水溶解RNA，55-60℃孵育5 min促进溶解。
关键试剂与条件
| 试剂/耗材 | 规格 | 用量 | 作用 |
|---|---|---|---|
| TRIzol Reagent | 含异硫氰酸胍+酸性酚 | 750 μL/250 μL样本 | 裂解+分相 |
| 氯仿 | 分子生物学级 | 200 μL/样本 | 萃取蛋白和脂质 |
| 糖原 | 20 mg/mL, RNA级 | 1 μL/样本 | 共沉淀载体 |
FAQ
Q：Trizol和柱提法哪个得率高？
A：Trizol法总RNA得率通常高20-30%，但纯度和完整性不如柱提法。Trizol提取的RNA 260/280常偏低（1.6-1.8 vs 柱提法1.8-2.0），因残余酚吸收峰在270 nm。要求高纯度的下游应用（RNA-seq）优先选柱提法。
Q：为什么要在4℃离心？
A：抑制内源性RNase活性（37℃时RNase A活性最高）。室温离心RNA降解风险明显增加。但4℃下GdSCN-核酸复合物更稳定，分相更清晰。
Q：微量RNA看不见沉淀怎么办？
A：加入糖原（Glycogen）作为共沉淀载体，白色颗粒可见。病毒RNA量极低时（<1>
参考文献
- Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987;162(1):156-159. DOI: 10.1016/0003-2697(87)90021-2
- Rio DC, Ares M Jr, Hannon GJ, et al. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010;2010(6):pdb.prot5439. DOI: 10.1101/pdb.prot5439