原理

病毒蛋白编码基因在宿主免疫、抗病毒药物和跨种传播三重压力下发生适应性进化。鉴定哪些氨基酸位点受到了正选择（dN/dS > 1）还是净化选择（dN/dS < 1），是理解病毒溯源中关键分子事件的前提。

HyPhy 在一个统一的系统发育框架下，用密码子置换模型比较非同义替换率（dN）和同义替换率（dS）。比值 ω 是衡量选择压力的核心指标。和传统 PAML 只提供有限 M 系列模型不同，HyPhy 内嵌了一整套方法矩阵：基因水平的 BUSTED、分支水平的 aBSREL、位点水平的 FUBAR/FEL（普遍选择）和 MEME（间歇选择）。这些方法共享同一套比对和树文件，输出结构化 JSON，一条命令跑到底。在 SARS-CoV-2 刺突蛋白受体结合域适应性进化与流感 HA 抗原漂移溯源案例中有广泛应用。

步骤

1. 密码子比对与系统发育树准备

输入文件是两条：密码子多序列比对（FASTA 或 NEXUS 格式）和对应的系统发育树（Newick 格式）。比对前务必检查序列不含内部终止密码子，也不存在移码。MAFFT 没有密码子感知（codon-aware）比对模式——直接对核苷酸做比对会破坏密码子读码框。标准做法是先将核苷酸序列翻译为氨基酸，用 MAFFT 做氨基酸比对，再用 pal2nal 把氨基酸比对回译为密码子比对。也可以用 TranslatorX（在线整合翻译+比对+回译流程）、MACSE（原生密码子感知，可处理移码）或 PRANK（含密码子模型）。建树用 IQ-TREE 的最大似然法。比对和树的序列名必须严格一致。

# 先翻译为氨基酸，再比对，最后回译（pal2nal 方案）
seqkit translate input_nt.fasta > input_aa.fasta
mafft --auto input_aa.fasta > aligned_aa.fasta
pal2nal.pl aligned_aa.fasta input_nt.fasta -output fasta > aligned_codon.fasta
# 建树
iqtree2 -s aligned_codon.fasta -m MFP -bb 1000 -nt AUTO

2. 基因与分支水平扫描

先用 BUSTED 判断整个基因是否存在正选择信号——它不指定特定分支，做全树扫描。再用 aBSREL 找出哪些具体分支（谱系）经历了适应性进化。aBSREL 对每个分支自动做模型选择，看是否需要引入 ω > 1 的速率类别。

hyphy busted --alignment aligned_codon.fasta --tree aligned_codon.fasta.treefile --srv Yes --output busted.json
hyphy absrel --alignment aligned_codon.fasta --tree aligned_codon.fasta.treefile --output absrel.json

3. 位点水平精细定位

基因和分支有信号后，定位到具体氨基酸位点。FUBAR 用贝叶斯 MCMC 在预置 ω 网格上快速逼近后验概率，适合大对齐（500 条序列以上）。MEME 检测只在部分分支上发生的间歇选择——病毒跨种传播和免疫逃逸中很常见。FEL 用似然比检验给出每个位点的显著性 P 值和 dN/dS 置信区间。

hyphy fubar --alignment aligned_codon.fasta --tree aligned_codon.fasta.treefile --output fubar.json
hyphy meme --alignment aligned_codon.fasta --tree aligned_codon.fasta.treefile --output meme.json
hyphy fel --alignment aligned_codon.fasta --tree aligned_codon.fasta.treefile --output fel.json

4. 结果筛选与生物学解读

解析各 JSON 输出文件。FUBAR 取后验概率 ≥ 0.9 的位点，FEL 和 MEME 取 P ≤ 0.1 的位点。将候选位点映射到蛋白三维结构或已知功能域上，判断其生物学意义。阳性位点取三种方法的并集，交叉验证。

参数选择建议

参数	推荐值	说明
--alignment	FASTA / NEXUS / phylip	密码子比对，不含终止密码子和移码
--tree	Newick 格式	与比对序列一一对应的系统发育树
--branches	Internal / Leaves / All	aBSREL 与 MEME 中指定待检分支子集
--srv	Yes / No（默认 Yes）	BUSTED 是否纳入同义速率变异
--starting-points	5~10	似然优化起始点数，越多越稳定但越慢
位点显著性阈值	P ≤ 0.1（FEL/MEME）	位点水平方法推荐宽松阈值
后验概率阈值	≥ 0.9（FUBAR）	贝叶斯方法高置信截断

FAQ

FUBAR 和 FEL 怎么选？

序列超过 500 条优先 FUBAR，速度比 FEL 快几十倍。小数据集两者均可，FUBAR 对弱选择信号更灵敏。需要 dN/dS 置信区间就加跑 FEL。没把握就两个都跑，取并集。

MEME 和 FUBAR 的结果不一致时信哪个？

不矛盾。FUBAR 检测全树持续作用的普遍选择，MEME 检测仅影响部分分支的间歇选择。一个位点只被 MEME 命中，说明它只在特定谱系里经历了正选择。阳性位点取并集。

为什么用 HyPhy 而不是 PAML 的 codeml？

方法矩阵更全。PAML 的 M7/M8 侧重回答基因是否存在正选择位点（M8+BEB 同样可以定位具体正选择位点），HyPhy 还能回答「哪个分支发生了选择」「选择是持续性还是间歇性」。另外 HyPhy 输出 JSON，命令行一行跑完，不用手写 ctl 文件。

参考文献

Kosakovsky Pond SL, Frost SDW, Muse SV. HyPhy: hypothesis testing using phylogenies. Bioinformatics. 2005;21(5):676-679. DOI: 10.1093/bioinformatics/bti079
Murrell B, Wertheim JO, Moola S, Weighill T, Scheffler K, Kosakovsky Pond SL. Detecting individual sites subject to episodic diversifying selection. PLoS Genetics. 2012;8(7):e1002764. DOI: 10.1371/journal.pgen.1002764
Murrell B, Moola S, Mabona A, Weighill T, Sheward D, Kosakovsky Pond SL, Scheffler K. FUBAR: A fast, unconstrained Bayesian approximation for inferring selection. Molecular Biology and Evolution. 2013;30(5):1196-1205. DOI: 10.1093/molbev/mst030
Spielman SJ, Weaver S, Shank SD, Magalis BR, Li M, Kosakovsky Pond SL. Evolution of viral genomes: interplay between selection, recombination, and other forces. Methods in Molecular Biology. 2019;1910:427-468. DOI: 10.1007/978-1-4939-9074-0_14

HyPhy选择压力分析——病毒适应性进化的dN/dS全谱检测流程

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